Про ошибки в диагностике

plus61

Читатель
Сообщения
95
Лайки
104
Баллы
34
Может пригодится. Программный перевод статьи:
Опубликовано онлайн 2023 Oct 5.
Перекрестная реактивность антител в серодиагностике болезни Лайма
Вероника Гронзлевска и Люцина Холек-Гонсиор*
Охад Мазор, научный редактор
Болезнь Лайма - это клещевое заболевание, вызываемое спирохетами, относящимися к комплексу Borrelia burgdorferi sensu lato. Заболевание характеризуется разнообразным течением, поэтому основой диагностики являются лабораторные методы. В настоящее время рекомендуется двухуровневое серологическое исследование, в котором в качестве скринингового теста используется ИФА, а в качестве подтверждающего - Вестерн-блот. Такой подход был введен в связи с относительно высоким числом ложноположительных результатов, полученных при использовании только ИФА. Однако даже такой подход не позволил полностью решить проблему ложноположительных результатов, вызванных перекрестными реакциями антител. Многие высокоиммуногенные белки B. burgdorferi s.l. неспецифически распознаются антителами, направленными против других патогенов. Это относится и к таким антигенам, как OspC, BmpA, VlsE и FlaB, т.е. к тем, которые обычно используются в серодиагностических анализах. Перекрестные реакции могут быть вызваны как бактериальными (возвратная лихорадка Borrelia, Treponema pallidum), так и вирусными (вирус Эпштейна-Баар, цитомегаловирус) инфекциями. Кроме того, было показано, что ревматоидный фактор неспецифически распознает белки B. burgdorferi s.l., что приводит к ложноположительным результатам. Поэтому необходимо тщательно интерпретировать результаты серодиагностических тестов, чтобы избежать гипердиагностики болезни Лайма, которая приводит к неоправданному применению сильной антибиотикотерапии и задержке постановки правильного диагноза.

Ключевые слова: Borrelia burgdorferi s.l., болезнь Лайма, серодиагностика, перекрестная реактивность

1. Введение
Болезнь Лайма - это клещевое заболевание, вызываемое бактериями, входящими в комплекс Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi s.l.). В настоящее время на основании филогенетического сходства в составе комплекса B. burgdorferi s.l. насчитывается около 21 геновида, однако в связи с попытками выделения и описания новых штаммов считается, что это число не окончательное [1].

Не все бактерии, относящиеся к этой группе, вызывают боррелиоз. В Европе существует шесть геновидов, вызывающих заболевание у человека: Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia bavariensis, Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.), Borrelia lusitaniae и Borrelia spielmanii. В течение многих лет считалось, что Borrelia burgdorferi s.s. является единственным геновидом возбудителя болезни Лайма в Северной Америке. Однако в последние годы появляется все больше сообщений о том, что Borrelia bisettii и Borrelia mayonii также могут вызывать болезнь Лайма в США и Канаде [2,3,4].

Переносчиками B. burgdorferi s.l. являются клещи рода Ixodes, и именно территория их естественного обитания определяет зону возникновения болезни Лайма. Существует четыре основных вида клещей, передающих болезнь Лайма человеку: Ixodes scapularis на востоке США и в Канаде; Ixodes pacificus на западе США; Ixodes ricinus в Европе и Азии; Ixodes persulcatus, встречающийся только в Азии [5]. Клещи заражаются B. burgdorferi s.l. при питании позвоночными животными, являющимися резервуарами для патогенов. После того как B. burgdorferi s.l. попадает в организм арахнида с кровью, спирохеты локализуются в его средней кишке. Повышение температуры и изменение pH внутри клеща, сопровождающие сбор крови, являются стимулами для начала экспрессии нового генофонда B. burgdorferi s.l.. Это позволяет спирохетам мигрировать из средней кишки в слюнные железы клеща, откуда они вместе со слюной попадают в организм нового позвоночного хозяина (в том числе и человека) [6,7].

Впервые болезнь Лайма была описана у жителей города Лайм (штат Коннектикут, США). У них был отмечен ревматоидоподобный артрит, которым страдали в основном дети [8]. Однако в течение многих лет этиология этого заболевания оставалась неизвестной. Лишь в начале 1980-х годов Вилли Бургдорфер первым обнаружил новый вид спирохет, обитающих в клещах, и связал его с наблюдаемыми симптомами [9]. В настоящее время болезнь Лайма является наиболее распространенной клещевой инфекцией в Северном полушарии. Рост числа случаев заболевания в основном связан с изменением климата, которое приводит к увеличению численности клещей и продлению времени их питания [10]. О серьезности проблемы свидетельствует тот факт, что во многих странах осуществляется эпидемиологический надзор за болезнью Лайма [11]. В Европе ежегодно регистрируется около 85 000 случаев ЛБ [12].

B. burgdorferi s.l. не продуцирует классических токсинов или других узнаваемых факторов вирулентности, непосредственно вызывающих повреждение тканей хозяина. Поэтому, по-видимому, мультисистемные нарушения обусловлены слишком сильными иммунными реакциями на бактериальные компоненты [13]. В течении болезни Лайма выделяют три стадии: раннюю, раннедиссеминированную и позднюю (рис. 1) [1,14,15].

Наиболее характерным проявлением ранней стадии болезни Лайма является поражение кожи, называемое мигрирующей эритемой (МЭ), которая появляется примерно у 60-90% инфицированных B. burgdorferi s.l. примерно через 3-30 дней после укуса клеща [14,16]. На этой стадии у пациентов могут отсутствовать другие симптомы или наблюдаться гриппоподобные проявления [17,18]. Если инфекцию не лечить, то через несколько недель или месяцев она может перейти в раннюю диссеминированную стадию. Наиболее распространенные нарушения включают нехарактерные боли в суставах и/или мышцах и синовит. На второй стадии заболевания, особенно у детей, может развиться и ранний нейроборрелиоз [1,14,15]. Одной из возможных форм заболевания на этой стадии являются также кардиальные нарушения, встречающиеся примерно у 5-10% больных. У небольшой группы пациентов может также развиться вторичная эритема, которая, однако, меньше первичного поражения и имеет равномерную окраску [14,19,20]. Поздняя фаза болезни Лайма - это хроническая инфекция, которая развивается от одного до нескольких лет после заражения. Ее течение во многом зависит от геновида, вызвавшего заболевание, что, вероятно, обусловлено различным тканевым тропизмом отдельных представителей B. burgdorferi s.l. [21]. Поэтому между Европой и Северной Америкой, а также между различными регионами Европы наблюдаются некоторые расхождения в течении заболевания. B. afzelii ассоциируется почти исключительно с хроническим атрофическим акродерматитом (АХА). B. garinii и B. bavariensis часто ассоциируются с неврологическими симптомами, а B. burgdorferi s.s. в основном вызывает Лайм-артрит (ЛА) [22,23,24].

В связи с тем, что симптомы болезни Лайма недостаточно специфичны для постановки правильного диагноза, важную роль здесь играют лабораторные тесты. Поскольку прямые методы имеют много ограничений, связанных с наличием очень малого количества B. burgdorferi s.l. в клинических образцах и трудностями их культивирования, чаще всего используются непрямые тесты, основанные на выявлении антител класса M и G [25]. К сожалению, эти тесты из-за перекрестных реакций между используемыми в них белками B. burgdorferi s.l. и неспецифическими антителами, содержащимися в сыворотках крови человека, затрудняют диагностику, что приводит к гипердиагностике болезни Лайма. Это чревато серьезными последствиями для пациентов, которые впоследствии подвергаются ненужной сильной антибиотикотерапии, а постановка правильного диагноза затягивается, что может привести к катастрофическим последствиям.

В данной статье представлена проблема перекрестных реакций в серодиагностике болезни Лайма, приводящих к ложноположительным результатам, и обсуждаются возможные пути решения этой проблемы.

Далее сл часть 2
 

plus61

Читатель
Сообщения
95
Лайки
104
Баллы
34
2. Характеристика B. burgdorferi s.l.
B. burgdorferi s.l. - это микроареофильные грамотрицательные бактерии, относящиеся к типу Spirochaetes [26,27]. Благодаря наличию наружной и внутренней клеточных мембран эти микроорганизмы относятся к грамотрицательным бактериям, однако по строению они существенно отличаются от типичных представителей этой группы [28,29]. В структуре клетки B. burgdorferi s.l. выделяют следующие элементы: наружную липидную мембрану с множеством поверхностных липопротеинов, периплазматическое пространство, жгутик и внутреннюю цитоплазматическую мембрану, образующую протоплазматический цилиндр. Жгутики и пептидогликановый слой расположены в периплазматическом пространстве [28,29].

Полный геном B. burgdorferi s.l. состоит из линейной хромосомы и многочисленных кольцевых и линейных плазмид. Хромосома в основном кодирует гены домашнего хозяйства, и ее последовательность достаточно сильно сохраняется в пределах B. burgdorferi s.l. Плазмиды несут генетическую информацию, отвечающую за вирулентность и патогенность [30]. К настоящему времени идентифицировано около 21 различных плазмид, однако не все изоляты B. burgdorferi s.l. имеют их полный набор. Только плазмиды cp26, cp32 и lp54 необходимы для выживания бактерии в окружающей среде, поэтому они присутствуют во всех изолятах B. burgdorferi s.l. и характеризуются относительно высокой степенью сохранности нуклеотидной последовательности. Остальные имеют низкую степень сохранности и достаточно легко теряются, что связано с большими трудностями при лабораторном культивировании полностью вирулентных штаммов B. burgdorferi s.l. [30,31,32].

Вследствие сложной структуры генома B. burgdorferi s.l. характеризуются также очень разнообразным протеомом. Бактерии обладают способностью изменять свои поверхностные антигены в качестве проявления адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды. Различные белки присутствуют на поверхности клетки патогена во время его существования в клещах и позвоночных животных. Выработка белков, необходимых для проникновения и колонизации млекопитающих, обычно начинается в ответ на изменение условий во время питания клеща кровью. Повышение температуры и снижение pH являются сигналом к началу миграции спирохет в слюнные железы арахнид и выработке новых белков, необходимых для передачи инфекции [30,33].

Среди всех белков Borrelia наиболее известны поверхностные антигены, которые делятся на две основные категории: липопротеины, которые крепятся к наружной мембране липидными молекулами на N-конце, и интегральные белки наружной мембраны (OMPs), которые крепятся трансмембранными доменами [34]. OMPs относительно хорошо консервативны среди B. burgdorferi s.l., на что влияет расположение почти всех известных генов, кодирующих OMPs, на хромосоме. В основном они отвечают за функции, необходимые для выживания бактериальной клетки, такие как получение питательных веществ или устойчивость к антибиотикам [34,35]. На поверхности спирохет преобладают липопротеины, большинство из которых кодируется плазмидами, что обусловливает относительно низкую сохранность в пределах B. burgdorferi s.l. В основном характер экспрессии кодируемых плазмидами липопротеинов меняется на протяжении всего жизненного цикла спирохеты в ответ на изменение условий окружающей среды. Это свидетельствует о том, что поверхностные липопротеины играют важную роль в вирулентности и взаимодействии хозяин-патоген, а также, как было показано, участвуют в уклонении от иммунного ответа хозяина. Это мнение подтверждается наблюдением, что потеря плазмид коррелирует со снижением инфекционности B. burgdorferi s.l. [34,36,37].

Краткая характеристика наиболее иммуногенных белков B. burgdorferi s.l. приведена в табл. 1. (см оригинал статьи)
 

plus61

Читатель
Сообщения
95
Лайки
104
Баллы
34
3. Диагностика болезни Лайма
Для большинства бактериальных заболеваний золотым стандартом считается прямое обнаружение возбудителей с помощью культуры. К сожалению, этот подход не используется в диагностике болезни Лайма из-за очень высоких требований к росту спирохет, низкого количества B. burgdorferi s.l. в собранных образцах и длительного времени ожидания результата. Перечисленные недостатки обусловливают использование этого метода в основном у пациентов с нарушениями в работе иммунной системы [1,63,64].

В настоящее время в диагностике болезни Лайма рекомендуется использовать двухуровневый серодиагностический подход. Благодаря высокой чувствительности и низкой стоимости ИФА-тесты выполняют роль скрининговых тестов. Однако положительный результат не означает достоверной диагностики болезни Лайма, так как ИФА-тесты имеют достаточно низкую специфичность. Вестерн-блот (ВБ) используется в качестве второго подтверждающего теста, поскольку благодаря возможности различать отдельные белковые полосы он гораздо более специфичен. Для достижения наибольшей диагностической эффективности в ВБ-тесте были отобраны наиболее реактивные и характерные антигены, продуцируемые B. burgdorferi s.l. Установлено, что для выявления иммуноглобулина М (IgM) наиболее полезными антигенами являются OspC (p23-p25), BmpA (p39) и FlaB (p41), и тест считается положительным при наличии реакции хотя бы на два из них [65]. Однако для выявления иммуноглобулина G (IgG) наилучшая специфичность и чувствительность достигается при использовании 10 различных антигенов, а именно DbpA (p18), OspC (p23-p25), OspD (p28), OspA (p30), BmpA (p39), FlaB (p41), p45, p58, p66 и p93. Тест считается положительным при появлении не менее 5 из 10 ожидаемых полос [66]. Основным источником антигенов в обоих методах являются лизаты целых клеток (ЛЦК) B. burgdorferi s.l.

Однако серодиагностика болезни Лайма сопряжена с рядом проблем, одной из которых является серологическое окно - время, необходимое иммунной системе для выработки специфических антител против возбудителей при первичной инфекции. Первыми в организме хозяина появляются IgM, это происходит примерно через 2 недели после заражения, а выработка IgG обычно начинается через 3-6 недель, и они заменяют IgM по мере прогрессирования заболевания. По мере развития инфекции иммунный ответ постепенно созревает, поэтому чувствительность серологических тестов на поздних стадиях заболевания значительно возрастает [1,67].

Еще одним ограничением является большое видовое разнообразие B. burgdorferi s.l., а низкая степень сохранности аминокислотных последовательностей белков между ними также негативно сказывается на эффективности серодиагностики болезни Лайма. Эта проблема особенно актуальна для Европы, где насчитывается до шести патогенных для человека геновидов. Большинство иммуногенных белков гетерогенны, поэтому использование в серодиагностике в качестве антигенных препаратов ВКЛ только одного геновида сопряжено с риском получения ложноотрицательного результата [1,32,68,69]. Кроме того, разнообразие поверхностных белков увеличивается за счет феномена антигенной вариабельности, что является одним из способов ухода от иммунного ответа B. burgdorferi s.l. Также проблематично получить ВКЛ, содержащие все наиболее иммуногенные антигены, поскольку некоторые из них продуцируются только in vivo [37,70]. Вышеперечисленные факторы вызывают проблемы, связанные со стандартизацией антигенных препаратов, что существенно влияет на воспроизводимость результатов диагностических исследований [36,71,72]. Кроме того, B. burgdorferi s.l. продуцирует множество белков, гомологичных микроорганизмам, что несет риск перекрестных реакций и приводит к ложноположительным результатам в серодиагностических тестах. Недостаточная специфичность диагностических тестов на болезнь Лайма послужила причиной введения в 1995 году двухуровневой стратегии тестирования [73,74].

Полученные исследователями результаты свидетельствуют о том, что рекомбинантные белки или синтетические пептиды способны решить некоторые проблемы, связанные с диагностикой болезни Лайма. Тщательный и продуманный подбор антигенов может снизить перекрестную реактивность и позволить сделать чувствительность теста независимой от геновида B. burgdorferi s.l., вызвавшего инфекцию, что упростит интерпретацию результатов диагностических анализов. Рекомбинантные белки уже используются во многих коммерческих серодиагностических ВБ- и ИФА-тестах (например, EUROLINE Borrelia-RN-AT (Euroimmun), recomLine Borrelia IgG/IgM (Microgen), Anti-Borrelia plus VlsE (Euroimmun), ZEUS ELISA Borrelia VlsE1/pepC10 IgG/IgM Test System (ZEUS Scientific, Branchburg, NJ, USA) и C6 Lyme ELISA kit (Immunetics, Norwood, MA, USA)) и вытесняют нативные белки B. burgdorferi s.l.

Наиболее широко в коммерческих диагностических тестах используются DbpA, OspC, VlsE и синтетические пептиды C6 и pepC10. Белки DbpA и VlsE в основном используются для выявления IgG-антител. В связи с высокой вариабельностью DbpA внутри комплекса B. burgdorferi s.l., для серодиагностических анализов их часто добавляют в вариантах из разных геновидов. Благодаря этому с помощью одного теста можно выявлять заболевания, вызванные разными представителями B. burgdorferi s.l. C6 - 25-аминокислотный пептид, полученный из VlsE. Его последовательность консервативна среди B. burgdorferi s.l., поэтому C6 широко используется в иммунодиагностических анализах [71]. OspC и полученный на его основе 10-аминокислотный pepC10 в основном используются для выявления IgM на ранних стадиях инфекции [75].
 

plus61

Читатель
Сообщения
95
Лайки
104
Баллы
34
4. Гипердиагностика болезни Лайма
Специфичность двухуровневых серологических тестов в научных исследованиях превышала 99%, однако в этих условиях они выполнялись в высокоэффективных референс-лабораториях. По многим данным, в реальной клинической практике двухуровневые тесты демонстрируют гораздо более низкую специфичность [73,74].

Несмотря на то что существует множество руководств, в которых точно описаны симптомы болезни Лайма на разных стадиях и диагностические тесты, которые необходимо проводить, эти рекомендации часто игнорируются. Это приводит к назначению тестов на болезнь Лайма в тех случаях, когда для этого нет четких медицинских показаний, что увеличивает количество ложно диагностированных больных болезнью Лайма. Поэтому следует избегать проведения серодиагностических тестов у лиц, не подверженных риску укуса клеща или имеющих лишь общие симптомы (например, боль и усталость) [76,77]. Существует также множество проблем, связанных с правильной интерпретацией результатов иммуноферментного анализа. Чрезмерное считывание слабых полос в ВБ-тесте может быть причиной некоторых ложноположительных результатов. Субъективная интерпретация результата является самым большим недостатком ВБ; она способствует низкому уровню воспроизводимости результатов в различных лабораториях [78,79].

Особенно это касается определения IgM, так как они являются антителами первого ряда. Поэтому их наличие часто ассоциируется с острой фазой инфекции. Тем не менее, их реактивность часто неспецифична, поскольку IgM вырабатываются, когда иммунный ответ на чужеродный антиген еще незрел. Поэтому IgM следует использовать только при подозрении на раннюю стадию болезни Лайма, т.е. при НБ продолжительностью <6 недель или Лайм-кардите (ЛК). Другие клинические симптомы, такие как ЛА и АКА, являются проявлениями позднего боррелиоза и появляются не менее чем через 6 недель. Поэтому в этих случаях следует проводить тесты, направленные на выявление более специфичных IgG [78].

На полезность серологических тестов влияет также высокая распространенность антител к B. burgdorferi s.l. Это особенно проблематично в Европе, поскольку, согласно докладу ВОЗ 1995 г., весь континент должен считаться эндемичной зоной по B. burgdorferi s.l. Исследования показали, что в некоторых регионах Европы в группах повышенного риска (охотники, фермеры) распространенность антител против антигенов B. burgdorferi s.l. превышает 50%, что означает, что положительный результат теста не всегда означает активность заболевания [76,80,81].

Оказывается также, что ложноположительные результаты могут быть обусловлены длительным пребыванием антиборрелийных антител в организме. Kalish et al. (2001) исследовали 79 пациентов, у которых болезнь Лайма была диагностирована 10-20 лет назад, а в настоящее время признаки активной инфекции отсутствуют. С помощью двухуровневого теста было показано, что до 25% из них имели специфические IgG и 10% - специфические IgM [82]. Антигены B. burgdorferi s.l., которые в основном распознавались специфическими IgM через много лет после заражения, были OspC и FlaB. Это означает, что антитела к таким белкам, как DbpA (p18), BmpA (p39), p45, p58 и p66, со временем исчезли [82]. Однако для IgG во многих случаях картина распознаваемых антигенов не изменилась даже через много лет. Наиболее узнаваемыми белками являются DbpA, BmpA, FlaB, p58 и p93 kDa. Пациенты, у которых ЛА развился при первой диагностике, демонстрировали особую стабильность в наличии антител, причем 62% из них оставались положительными по IgG и 15% по IgM даже через 10 лет [82].
 

plus61

Читатель
Сообщения
95
Лайки
104
Баллы
34
5. Расстройства, которые чаще всего путают с болезнью Лайма
Существует несколько инфекций/заболеваний, которые могут быть ошибочно диагностированы как болезнь Лайма или наоборот. Наиболее проблематичными являются сифилис, возвратная лихорадка и вирусные инфекции, вызванные вирусом Эпштейна-Барра (EBV) и цитомегаловирусом (CMV). Кроме того, у людей с положительной реакцией на ревматоидный фактор (РФ) также часто ошибочно диагностируется боррелиоз [83,84,85,86,87].

Боррелии возвратного тифа (RFB) - это бактерии, близкородственные B. burgdorferi s.l. В эту группу входят такие виды, как Borrelia hermsii, Borrelia miyamotoi, Borrelia hispanica Borrelia duttonii и Borrelia recurrentis. Эти бактерии можно разделить на боррелии клещевой лихорадки (LBRF) и боррелии клещевой возвратной лихорадки (TBRF). Боррелии TBRF обычно передаются мягкими клещами рода Ornithodoros. В настоящее время, по-видимому, только Borrelia miyamotoi передается жесткотелыми клещами; аналогичным образом, B. burgdorferi s.l. LBRF вызывается только Borrelia recurrentis [88]. TBRF Borrelia встречается на всех континентах, кроме Австралии и Антарктиды, и представляет собой серьезную проблему для здравоохранения в некоторых регионах мира. ЛБРФ регистрируется в основном в Африке, а единичные случаи в Европе встречаются в основном среди беженцев. В процессе развития возвратной лихорадки могут возникать многочисленные неспецифические симптомы (например, головная боль, миалгия, озноб, тошнота, рвота, артралгия) и неврологические нарушения (например, менингит, энцефалит, гемиплегия, лицевой паралич). Некоторые из них сходны с симптомами болезни Лайма, поэтому клиническая дифференциация этих двух инфекций в большинстве случаев невозможна. Следует помнить, что ЭМ не возникает при рецидивирующей лихорадке, которая является одним из симптомов, позволяющих легко и бесспорно дифференцировать эти заболевания. В прошлом для диагностики возвратной лихорадки использовался цельноклеточный лизат B. hermsii, однако слишком большое сходство антигенов этих двух групп бактерий приводило к большому количеству ложноположительных результатов. В настоящее время для диагностики возвратной лихорадки в основном используется qPCR. Кроме того, разработаны серологические тесты на основе глицерофосфодиэстеразы (GlpQ), отсутствующей у B. burgdorferi s.l. [85].

Сифилис - заболевание, передающееся половым путем и вызываемое спирохетами Treponema pallidum. Серологические тесты на сифилис на всех стадиях инфекции остаются основной основой диагностики. Антитела против антигенов T. pallidum часто реагируют с белками B. burgdorferi s.l., особенно в ИФА, когда в качестве источника антигенов используется WCL. Это объясняется близким филогенетическим родством этих двух возбудителей; такая перекрестная реактивность тесно связана с общими жгутиковыми антигенами [89]. В IgM перекрестные реакции возникают с белками B. burgdorferi s.l., такими как OspC, BBA64, BmpA, FlaB, OspF и OspC, BBA64, BmpA, FlaB и OspF в IgG [86]. Таким образом, он может вызывать ложноположительные результаты в иммуноферментном анализе, однако предшествующая инфекция B. burgdorferi s.l., по-видимому, не приводит к ложноположительному тесту на сифилис [90]. Было доказано, что перекрестные реакции между антигенами B. burgdorferi s.l. и T. pallidum можно свести к минимуму, инкубируя сыворотки с препаратами трепонемы Рейтера. Однако эта процедура не устраняет всех неспецифических взаимодействий [91,92].
Гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ), ранее известный как гранулоцитарный эрлихиоз человека, вызывается грамотрицательными внутриклеточными бактериями Anaplasma phagocytophilum. Основным путем передачи A. phagocytophilum является укус иксодовых клещей. Несмотря на, по-видимому, повсеместное присутствие A. phagocytophilum в клещах и резервуарах животных, подтвержденные клинические случаи ВГА в Европе редки по сравнению с остальным миром. Было показано, что сыворотки, собранные от больных ВГА, дают перекрестные реакции с белками B. burgdorferi s.l., такими как OspC, BBA64, p37, FlaB, VlsE, OspA, OspC и OspF в антителах класса M и OspC, p37, FlaB, OspA и OspF в IgG. Интересно, что, несмотря на обнаружение этих неспецифических реакций антиген-антитело, ИФА-тесты, выполненные на WCL, не давали ложноположительных результатов [86]. Однако реактивность сыворотки крови на антигены как B. burgdorferi s.l., так и A. phagocytophilum не всегда обусловлена перекрестными реакциями. Люди, проживающие в эндемичных по иксодовым клещам районах и подвергающиеся многократным укусам клещей, вероятно, подвергаются передаче различных патогенов. Возможно, что пациент с инфекцией HGE ранее был инфицирован B. burgdorferi s.l. или наоборот, и у него могут вырабатываться антитела к обоим патогенам. Кроме того, были подтверждены случаи совместного заражения людей и переносчиков [93,94]. Поэтому при подозрении на ГПЭ, болезнь Лайма или бабезиоз человека необходимо провести исследование на другое клещевое заболевание. Поскольку ЭМ часто отсутствует, клинические проявления ГПЭ, такие как головная боль, лихорадка и утомляемость, можно спутать с проявлениями Лайм-боррелиоза и других заболеваний. Лабораторные анализы для выявления нарушений, связанных с аномальным количеством клеток крови (т.е. тромбоцитопении или лейкопении), и определения концентрации печеночных трансаминаз в сыворотке крови могут помочь отделить ГПЭ от боррелиоза [93,95].

Люди заражаются Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis при употреблении загрязненной пищи или воды, а также при прямом заражении при переливании крови. Инфекция может протекать бессимптомно, но в некоторых случаях может развиться реактивный артрит, сходный с ЛА, вызванным B. burgdorferi s.l. Чаще всего поражаются коленные и голеностопные суставы, но могут быть задействованы и другие суставы, например, пальцев ног, пальцев рук и запястий. Как и в случае болезни Лайма, диагностика с помощью культур не очень чувствительна, поэтому полезными могут оказаться серологические тесты, выявляющие антитела к антигенам Yersinia [96,97]. Новейшие тесты на иерсиниоз направлены на выявление антител к внешним белкам иерсиний (YOPs) [98]. Сообщалось о перекрестной реактивности между антителами, специфичными для B. burgdorferi s.l.s., и YOPs в Вестерн-блотах. Для антиборрелиозных IgG перекрестная реакция была выявлена с YopH, YopB, V-ag, YopD, YopN, YopP и YopE, а для IgA - с YopD [96,97]. Все образцы сыворотки крови боррелий с отмеченной перекрестной реактивностью содержали IgG против FlaB и специфические IgG и IgM против OspC. Это может свидетельствовать о наличии антигенного сходства между антигенами OspC и FlaB B. burgdorferi s.l. и YopD Yersinia и двусторонней перекрестной реактивности. Было показано, что антигены p60, FlaB, OspA и OspC B. burgdorferi s.l. обладают высокой перекрестной реактивностью с антииерсиниозными сыворотками [96,97]. Поэтому в данном случае следует соблюдать особую осторожность, поскольку возможна гипердиагностика как болезни Лайма, так и иерсиниоза.

Вирус Эпштейна-Барр - гамма-герпесвирус, вызывающий инфекцию у людей во всем мире. Распространенность EBV очень высока; около 90% взрослых инфицированы им. Большинство случаев инфицирования приходится на детей младшего возраста и протекает бессимптомно или вызывает неспецифические симптомы [99]. Было замечено, что образцы сыворотки крови пациентов с EBV-инфекцией перекрестно реагируют с белком OspC B. burgdorferi s.l. В исследованиях Panelius et al. (2002) процент пациентов с положительным результатом на EBV в ИФА OspC первоначально достигал 73%, однако при добавлении тиоцианата натрия эта перекрестная реактивность была ограничена и снизилась до 46%. К сожалению, эффект снижения неспецифических реакций не наблюдался при использовании сывороток, специфичных для сифилиса и ревматоидного фактора [87].

Цитомегаловирус относится к вирусам порядка Herpesvirales. Обычно CMV-инфекция протекает бессимптомно, однако у людей с дефектной или незрелой иммунной системой, таких как новорожденные, люди с избыточным ростом и больные СПИДом, она может представлять серьезную проблему. Вирус имеет широкое распространение, и распространенность CMV в мире оценивается в 83% (66-90%) [100]. Это означает, что у большинства людей в мире (как и в случае с EBV) выработаны антитела к CMV, которые, как сообщалось, перекрестно реагируют с антигенами B. burgdorferi s.l. [83,84,101]. Некоторые коммерческие ИФА с использованием ВКЛ B. burgdorferi s.l. показали специфичность всего 60% для выявления антител класса М. Низкая специфичность в тестах с использованием сывороток CMV обусловлена перекрестной реактивностью IgM с OspC и FlaB (p41). Кроме того, было показано, что анти-CMV IgG распознают такие антигены B. burgdorferi s.l., как OspC, FlaB, BmpA и VlsE [83,84].

Парвовирус B19 (B19V) представляет собой небольшой одноцепочечный вирус с неразвитой ДНК. У взрослых он может вызывать боль в суставах или артрит с выраженной утренней скованностью, который может имитировать ЛА, вызванный B. burgdorferi s.l. [102]. Острая инфекция B19V может вызывать образование полиспецифических антител, перекрестно реагирующих с различными бактериальными антигенами, особенно с B. burgdorferi s.l. и другими неродственными патогенами, такими как Salmonella и Campylobacter. Эти антитела могут сохраняться в крови до 3 месяцев. Ложноположительные результаты на болезнь Лайма были получены не только в тестах EIA, но и в более специфичном Вестерн-блоте. Поэтому существует вероятность того, что острая B19V-инфекция может быть ошибочно интерпретирована как болезнь Лайма [103]. Одним из вероятных объяснений такой перекрестной реактивности является поликлональная стимуляция В-клеток, однако механизм этого явления еще не до конца изучен. Другим вероятным механизмом может быть молекулярная мимикрия. Однако отсутствие двусторонней перекрестной реактивности (B. burgdorferi s.l.-специфические антитела не распознают антигены B19V) подрывает эту теорию. Поэтому особое внимание следует уделять разумной интерпретации результатов IgM-серологии и исключению недавнего инфицирования пациентов B19V [103].

Одним из наиболее распространенных симптомов позднего боррелиоза (особенно в США) является Лайм-артрит. LA имеет общие клинические признаки и синовиальную гистологию с ревматоидным артритом (РА), поэтому клинические симптомы часто неразличимы. Рекомендуемые серологические тесты также могут приводить к ошибочному диагнозу из-за наличия РФ, которые присутствуют в сыворотке крови пациентов с артритом [104] и другими системными заболеваниями [105]. РФ представляют собой антитела, специфически направленные против гамма (γ) глобулина, и являются наиболее распространенными аутоантителами, когда-либо описанными у человека [105]. Исследования показали, что РФ реагируют со многими антигенами B. burgdorferi s.l., включая LA7 (p22), BBA64 (p35), p37, BmpA, OppA2, VlsE и OspC [86,87,106,107]. Кроме того, в сыворотках некоторых больных РА обнаруживались антитела, направленные против OspA, что также может быть источником ложноположительных результатов серологических тестов [104].


Кроме того, было отмечено, что у пациентов с инфекциями полости рта возникают перекрестные реакции с антигенами B. burgdorferi s.l., такими как p37, BmpA, OspF и OspC; однако этот феномен до конца не изучен [106,108].
 

plus61

Читатель
Сообщения
95
Лайки
104
Баллы
34
6. Перекрестно-реактивные белки B. burgdorferi s.l.
Проблема перекрестных реакций при серодиагностике болезни Лайма известна давно. В начале 1990-х годов было проведено исследование по выявлению перекрестно-реактивных антигенов B. burgdorferi s.l. с целью повышения специфичности диагностических тестов [109]. Исследования, проводившиеся в течение многих лет, были направлены на выявление перекрестной реактивности наиболее иммуногенных антигенов, которые могут иметь диагностическое значение, поэтому в этом отношении были охарактеризованы в основном поверхностные белки (табл. 2).
см. таблицу в оригинале статьи.

OspA и OspB относятся к числу белков, которые могут приводить к ложноположительным результатам серодиагностических тестов на болезнь Лайма. Это довольно удивительно, если учесть, что они продуцируются B. burgdorferi s.l. в процессе их персистенции в организме клеща. Тем не менее, многочисленные исследования показали наличие антител к этим белкам в сыворотках людей, страдающих болезнью Лайма. OspA даже был включен в качестве специфической полосы в референсные ВБ-анализы [19,66,85]. Было показано, что антитела против таких патогенов, как A. phagocytophilum, T. pallidum, Yersinia, E. coli и B. hermsii, могут неспецифически связывать OspA и/или OspB [34]. Кроме того, OspA, по-видимому, отвечает за аутоиммунный ответ организма человека, приводящий к различным заболеваниям. Одним из них является хронический, устойчивый к антибиотикотерапии Лайм-артрит, который встречается у некоторой части пациентов. Представляется вероятным, что это связано с перекрестной реактивностью OspA-специфических антител с тканями человека. Сходство в аминокислотной последовательности было обнаружено между OspA (165-173) и лейкоцитарным функционально-ассоциированным антигеном 1α, аминокислотные позиции 332-340 (LFA-1α 332-340) [111].

Другим перекрестно реагирующим антигеном может быть цитокератин 10, который присутствует в эндотелии синовиальных микрососудов и перекрестно реагирует с OspA [112]. Также было замечено, что уровень анти-OspA IgG прямо коррелирует с тяжестью и продолжительностью болезни Лайма. Кроме того, анализ последовательности кДНК, полученной из нервной ткани, показал, что в ней можно обнаружить три фрагмента, идентичных аминокислотным последовательностям белка OspA. Было показано, что антитела, специфичные к двум из выявленных фрагментов, также реагируют с нейронами головного, спинного мозга и дорсальных корешковых ганглиев человека. У некоторых пациентов, несмотря на прием соответствующих антибиотиков, сохраняются неврологические или когнитивные симптомы. Поэтому вполне вероятно, что эти симптомы вызваны не персистирующей инфекцией, а иммуноопосредованными нарушениями [113].

Другим белком с хорошо описанной перекрестной активностью является OspC. Несмотря на то, что он широко применяется в качестве антигена в коммерческих диагностических анализах для выявления как IgG-, так и IgM-специфических антител к B. burgdorferi s.l., было показано, что у людей с различными инфекциями и заболеваниями могут образовываться антитела, неспецифически связывающиеся с белком OspC [114]. К таким заболеваниям относятся ВГА, возвратная лихорадка, оральная инфекция, B19, CMV, EBV-инфекция и наличие РФ. Одним из источников этих перекрестных реакций может быть С-концевой эпитоп (PKKP) OspC. С помощью анализа Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) было установлено, что этот эпитоп присутствует во многих белках, в том числе и в двух человеческих, таких как триптаза человека (TPSAB1) и синаптоджанин-2 изоформа X5 [115]. Более того, этот белковый мотив был обнаружен также у бактерий и съедобных растений. Это можно объяснить тем, что выработка была инициирована инфицированием B. burgdorferi s.l. и поддерживается на высоком уровне путем постоянной стимуляции перекрестно-реактивными аутоантигенами или антигенами других микроорганизмов или факторов окружающей среды. Этому может способствовать и рацион питания, поскольку мотив PKKP можно обнаружить в глутатионтрансферазе таких важных сельскохозяйственных культур, как обычная пшеница и ячмень [115].

FlaB (p41) демонстрирует высокую последовательную идентичность (около 40%) с белками флагеллинов Treponema spp. Особенно консервативными у этих бактерий являются фрагменты на концах белка (первые 130 и конечные 70 остатков); центральная часть антигена отличается большей вариабельностью [116]. FlaB проявляет высокую реактивность с антителами, особенно на начальных стадиях инфекции, и для использования диагностического потенциала этого белка используется более специфичный внутренний фрагмент p41/i, включающий аминокислотные остатки 129-251 [1,117]. Однако Luft et al. (1993) показали, что фрагмент, содержащий аминокислоты 131-234, распознается антителами, содержащимися в сыворотках больных сифилисом. Таким образом, эта область p41 также содержит перекрестно-реактивные эпитопы [118].
Анализ in silico показал, что пептид С6 сходен с доменами вариабельных основных белков (Vmps) B. miyamotoi, относящихся к семейству вариабельных больших белков (Vlp), которые являются гомологами VlsE. B. miyamotoi является этиологическим фактором TBRF, передающимся иксодовыми клещами, а также B. burgdorferi s.l. Перекрестная реакция антител против B. miyamotoi на пептид C6 была подтверждена в исследовании на экспериментально зараженных мышах [119]. Такая перекрестная реактивность весьма проблематична, поскольку B. miyamotoi и B. burgdorferi s.l. обитают в одном эндемичном регионе, поэтому следует отметить, что сам по себе пептид С6 не позволяет серологически дифференцировать эти два клещевых заболевания. Поэтому для того, чтобы отличить боррелиоз от инфекции B. miyamotoi, необходимо двухэтапное обследование, а также критическая оценка клинических симптомов [119].

Chandra et al. (2011) сообщили, что около 20% здоровых людей без истории болезни Лайма имели IgG-антитела к p66 [120], что является проблематичным, поскольку полоса p66 включена в диагностические критерии CDC IgG Western blot [73]. Эти результаты были подтверждены путем картирования эпитопов с использованием технологии микрочипов. Этот эксперимент показал, что белок p66 содержит множество линейных перекрестно-реактивных эпитопов, причем в образцах сыворотки, независимо от происхождения или состояния заболевания, были обнаружены антитела, распознающие множество линейных эпитопов p66. Эти результаты свидетельствуют о том, что его диагностическая польза сомнительна и может искажать истинный результат теста [56]. BLAST-анализ пептидных последовательностей не позволил идентифицировать какие-либо специфические белки других бактерий, которые могли бы способствовать образованию перекрестно-реактивных эпитопов. Однако перекрестная реактивность может быть вызвана значительным количеством экологических, бактериальных, вирусных и других антигенов, которые не содержатся в базах данных последовательностей [56].
Кроме того, доказана перекрестная реактивность антигенов B. burgdorferi s.l., таких как BmpA, BBA64, OspF, LA7 и OppA2 (табл. 2). BmpA перекрестно реагирует с антителами, направленными против сифилиса, возвратной лихорадки, CMV и B19, а также распознается ревматоидным фактором. Показано, что LA7 и BBA64 распознаются антителами, содержащимися в сыворотке крови людей, больных сифилисом, а также ВГА и РФ-положительных пациентов. Более того, BBA64 также проявляет реактивность с анти-иерсиниозными и анти-РФ боррелиозными антителами. Однако исследования на основе антигена OppA2, который не часто используется в диагностике болезни Лайма, но привлек внимание ученых благодаря его продукции на ранних стадиях инфекции, показали, что этот белок содержит линейные эпитопы, распознаваемые неспецифически антителами, содержащимися в сыворотках, собранных от людей, больных сифилисом и ревматоидным артритом [58].

Помимо этих антигенов, важно помнить и о тех высококонсервативных белках, которые отвечают за основной метаболизм клетки B. burgdorferi s.l. и гомологи которых продуцируются многими другими организмами. И хотя сами по себе они не признаны маркерами болезни Лайма, они могут способствовать получению ложноположительных результатов в ИФА при использовании WCL в качестве антигена. Одним из примеров такого белка является GroEL, высококонсервативный белок теплового шока, имеющий большое сходство с белками многих других бактерий [65,118].
 

plus61

Читатель
Сообщения
95
Лайки
104
Баллы
34
7. Выводы и дальнейшие направления
Симптомы болезни Лайма (за исключением ЭМ) неспецифичны, что делает невозможным ее правильную диагностику на основании клинической картины. По этой причине основой диагностики болезни Лайма являются лабораторные методы, где чаще всего выявляются специфические IgM и IgG [121]. Серодиагностика болезни Лайма, несмотря на многолетние усилия, до сих пор вызывает проблемы. Основными причинами этого являются сложная антигенная структура спирохеты, низкая степень сохранения белковых последовательностей у разных геновидов и частые перекрестные реакции [1,122].
Именно эти неспецифические взаимодействия накладывают отпечаток на рекомендуемый в настоящее время двухуровневый алгоритм серодиагностики болезни Лайма, увеличивая затраты на рутинную диагностику болезни Лайма и удлиняя время, необходимое для постановки окончательного диагноза. Представляется, что наиболее проблемным в существующем подходе является ВБ, которая требует много времени и трудно поддается автоматизации. Кроме того, ее прочтение, как уже отмечалось, носит субъективный характер, что приводит к значительным расхождениям между лабораториями [1,77,78,79]. До настоящего времени проблема перекрестных реакций при болезни Лайма не изучалась многими учеными, было проведено лишь несколько комплексных исследований, направленных на выявление широкого круга потенциальных заболеваний/патогенов, вызывающих ложноположительные результаты анализов, и на характеристику перекрестно-реактивных белков B. burgdorferi s.l. [60,83,109,123]. В большинстве случаев такие исследования были посвящены отдельным антигенам или патогенам, среди которых преобладали флагеллин [118] и T. pallidum [89,90] и Yersinia [96,97,124] соответственно.

Знания о перекрестной реактивности в основном получают в качестве дополнительной информации при определении диагностической полезности новых тестов на основе рекомбинантных белков [60,86,108]. Обычно в таких исследованиях тестируется небольшое количество сывороток, содержащих антитела против патогенов, являющихся потенциальным источником перекрестных реакций. Кроме того, эти результаты были получены с использованием различных методик (ВБ [96,110], ИФА [60,86,108], иммунофлюоресценция [83], коммерческие анализы [83,107]) и форм антигенов (нативные антигены [89,110], рекомбинантные белки [60,86,108]). В результате содержащуюся в литературе информацию зачастую трудно сопоставить и интерпретировать.
Поэтому необходимо проводить комплексные, широкомасштабные исследования с использованием единых стандартов. Это позволит четко определить инфекции/заболевания и антигены, которые потенциально могут вызывать перекрестные реакции при серологической диагностике болезни Лайма, что позволит диагностам быть более подготовленными к интерпретации результатов. Кроме того, в процессе диагностики необходимо следовать официальным рекомендациям. Важно помнить, какие симптомы являются проявлением позднего боррелиоза, и тогда проводить только определение высокоспецифичных IgG.
Кроме того, решению этой проблемы может способствовать создание новых диагностических средств. Показано, что использование в серодиагностических тестах вместо ВКЛ отдельных рекомбинантных белков может существенно снизить частоту ложноположительных результатов [86,108]. Несмотря на развитие генной инженерии для получения рекомбинантных белков B. burgdorferi s.l., специфический одностадийный анализ, превосходящий стандартный двухстадийный, до сих пор не разработан [1,77,78,79]. Иммуноферментный анализ на основе единичных рекомбинантных белков может иметь низкую чувствительность, поскольку в ВКЛ существуют сотни антигенов, которые могут распознаваться специфическими антителами. При использовании единичных белков количество эпитопов, взаимодействующих с иммуноглобулинами, значительно сокращается. Более высокая чувствительность иммуноферментного анализа может быть достигнута за счет использования химерных белков, которые содержат в одной аминокислотной цепи выбранные иммунодоминантные фрагменты нескольких белков. Это означает, что такой белок может распознаваться антителами, специфичными к нескольким антигенам [125,126]. Однако для того, чтобы продемонстрировать максимально возможную диагностическую эффективность, такие химерные белки должны быть рационально сконструированы [127,128]. Это означает, что они должны распознаваться антителами против различных геновидов B. burgdorferi s.l. и не вступать в перекрестную реакцию с иммуноглобулинами, специфичными к другим антигенам.

Наиболее простым и доступным подходом для разработки новых специфических антигенов для диагностики болезни Лайма является анализ аминокислотных последовательностей белков. В настоящее время существует большое количество баз данных, содержащих аминокислотные последовательности белков многих организмов. Наиболее популярными из них являются UniProt [129] и NCBI-Protein [130], содержащие миллионы белковых последовательностей в своих коллекциях. В сочетании с такими биоинформационными инструментами, как Protein Basic Local Alignment Search Tool (BLASTp) и ClustalX, эти данные позволяют быстро и просто оценить уровень сохранности белков B. burgdorferi s.l. [131,132], а также оценить сходство последовательностей с антигенами других организмов и тем самым определить возможность перекрестной реактивности. Такой подход позволяет отбирать фрагменты для конструирования химерных белков, поскольку позволяет включать только те фрагменты, которые сохранились в B. burgdorferi s.l., и исключать те, которые часто встречаются в антигенах других патогенов. Уже на примере VlsE и FlaB было показано, что правильный подбор белковых фрагментов позволяет повысить специфичность без снижения чувствительности иммуноанализа [133,134].

Еще большие возможности в выборе фрагментов для конструирования химерных белков предоставляет В-клеточное эпитопное картирование, позволяющее детально изучить распределение иммунодоминантных фрагментов и потенциальных фрагментов перекрестных реакций [135,136]. Существует несколько методов идентификации конформационных и линейных эпитопов, включающих как вычислительные, так и экспериментальные методы [137,138].

Вычислительные методы предсказывают существование потенциальных эпитопов на основе таких физико-химических свойств, как гидрофильность, доступность растворителя, гибкость, повороты, полярность, антигенность и воздействие на поверхность. В целом вычислительные методы предсказания эпитопов можно разделить на две группы в зависимости от того, что является исходным материалом - аминокислотная последовательность антигена или его третичная структура. Методы, использующие трехмерную структуру белка, отличаются большей регулярностью; к сожалению, их применение не всегда возможно из-за того, что пространственная структура многих белков не известна [138]. Однако, несмотря на то что методы in silico экономят время и средства, они позволяют лишь на начальном этапе выявить потенциальные антигенные детерминантные последовательности. Полученные результаты целесообразно подтверждать экспериментальными методами [137,139].

Информация, получаемая с помощью эмпирических методов, гораздо более полна и надежна. Экспериментальное сопоставление эпитопов В-клеток включает такие методы, как пептидный микрочип [140], рентгеновская кристаллография комплексов антиген-антитело [141] и ядерный магнитный резонанс [137]. Их основное преимущество заключается в том, что они позволяют выявить перекрестно-реактивные эпитопы, благодаря чему эти фрагменты могут быть исключены и не использованы при конструировании химерных белков [135,136,142]. Другим аспектом является возможность различать фрагменты антигенов, реагирующих с различными классами иммуноглобулинов [143], и таким образом конструировать химерные белки, предназначенные для выявления определенного изотипа антител. Таким образом, представляется, что данный подход может стать ключом к разработке новых инструментов, способствующих повышению специфичности и чувствительности серодиагностики болезни Лайма, ограничению числа неоправданных антибиотикотерапий и ускорению постановки правильного диагноза пациентам.
Ссылки на источники см. в оригинале статьи.
 
Сверху Снизу