Обсуждения Э.И.Коренберг и др. "Природноочаговые инфекции, передающиеся иксодовыми клещами"

[Ирина]

"Методы прямого обнаружения возбудителей и/или их компонентов рассматриваются как дополнительные к серологии тесты. Их применяют при неоднозначных или отрицательных результатах серологического тестирования, в основном
на ранних стадиях заболевания (до введения специфического противоклещевого иммуноглобулина или до начала проведения антибиотикотерапии)."

"В основе проведения лабораторной диагностики иксодовых клещевых боррелиозов лежит исп. метод. указаний
МЗ СССР, разработанных еще в 1991 г. (МУ, 1991); безусловно, эти документы требуют уточнения с учетом современного уровня развития диагностических технологий. Методические указания по проведению лабораторной диагностики
ГАЧ и МЭЧ в нашей стране пока вообще не разработаны, поэтому для проведения диагностического тестирования и
интерпретации его результатов лабораторные работники используют рекомендации производителей тест-систем."

"Успех лабораторной диагностики в значительной степени зависит от стандартизации всех этапов лабораторного исследования: преаналитического (подготовка пациента к обследованию, взятие пробы, ее транспортировка и хранение,
подготовка пробы к исследованию и т. п.), аналитического (анализ биологических материалов с помощью лабораторных тестов) и постаналитического (интерпретация результатов исследования, постановка клинического диагноза, определе-
ние тактики лечения и/или плана диспансерного наблюдения и т. п.)."

"Преаналитический этап. В целом, на этот этап приходится до 60 % времени, затрачиваемого на лаб. исследования, из
них 20 % —вне стен лаборатории (Guder et al., 2003; Мошкин, Долгов, 2004). Ошибки преаналитического этапа могут
приводить к искажению результатов лабораторных исследований и, как следствие, к неправильной постановке диагноза, назначению неправильной терапии, к удорожанию и удлинению сроков лечения. Ошибки на этом этапе могут составлять более 70 % в общей структуре лабораторного исследования (Меньшиков, 2012) и в основном обусловлены ошибками при выборе тестов, при составлении заявки, при сборе образцов (гемолиз, свертывание, недостаточный объем, и т. д.), а также неверной идентификацией пациентов и/или образцов, использованием неподходящих емкостей, неправильным обращением, хранением и транспортировкой проб; до 5 % и более могут составлять ошибки в результате неправильной сортировки проб, неточности при аликвотировании, пипетировании и маркировке и т. п. (Plebani,2010)."

"Одна из наиболее острых проблем, затрудняющих стандартизацию преаналитического этапа, —использование ・・открытого・・ способа забора крови (либо шприцом, либо полой иглой в пробирку самотеком) в подавляющем (до 90 %) числе российских лабораторий; применение закрытых (вакуумных) систем взятия крови может существенно повысить точность и сопоставимость исследований. Рекомендации по проведению преаналитического этапа даны в ГОСТ Р 53079.4–008."

" Аналитический этап. Аналитический этап —・・сердце・・ лабораторной работы и аналитического процесса,
проходящего под контролем лабораторного персонала. Ошибки на этом этапе (от 7 до 13 %) могут возникать в результате неисправности оборудования, перепутывания клинических проб, невыявленной ошибки контроля качества и т. п. (Plebani, 2010)."

— необходимо использовать зарегистрированные в системе МЗ РФ тесты.Это первый этап-стандартизации,
обеспечиваемый производителем диагностического теста, поскольку регистрации подлежат только те медицинские изделия, которые подтвердили свою эффективность в рамках медицинских испытаний
на нескольких клинических базах;
— необходимо строго соблюдать инструкцию по применению диагностического теста. Инструкция по применению
тест-системы содержит сведения по проведению преаналитического (усл. взятия проб и их подгот. к анализу, ог-
раничения и предосторожности при проведении анализа и т. п.), аналитического (подробное описание отдельных стадий анализа и оценки его результатов) и постаналитического (рекомендации по интерпретации результатов исследования) этапов, необходимые для качественного выполнения лабораторного исследования;
— необходимо использовать тесты с высокими показателями диагностической чувствительности и специфичности.
Диагностическая чувствительность (ДЧ) и диагностическая специфичность (ДС) явл. основными характеристиками
лабораторного теста, которые определяют его диагностическую эффективность и должны учитываться при решении вопроса о том, стоит ли назначать данный тест (Флэтчер и др., 1998; ГОСТ Р 53022.3–008). ДЧ теста отражает вероятность
его положительного результата в присутствии патологии; высокочувствительные тесты позволяют выявлять больных среди населения. ДС отражает вероятность отрицательного результата в отсутствие патологии, что при высокой специфичности позволяет отсеивать здоровых из популяции с предполагаемой патологией. Обычно показатели ДЧ и ДС указываются в инструкциях производителей тест-систем (по крайней мере, зарубежных) в сопоставлении с данными других коммерческих тестов или могут быть рассчитаны лабораторным работником по мере накопления
данных о реальном применении тест-системы в группах здоровых лиц и пациентов, заведомо страдающих предполагаемой патологией. При этом следует понимать, что показатели ДЧ и ДС, приводимые производителем тест-систем, в реальной клинической практике могут сильно отличаться от ожидаемых, поскольку совершенно
очевидно зависят от срока применения теста от начала заболевания и используемой для расчетов выборки пациентов
(например, включение в выборку пациентов с определенными заболеваниями может влиять на специфичность анализа), а также от целого ряда других факторов (раздел 7.1.1, 7.3.4);
— необходимо проводить внутрилабораторный контроль качества (ВЛКК).он необходим для оценкикач. работы
лабораторий, квалификации лабораторного персонала, выявления ошибок в иммунодиагностике и устранения их
причин."


"К сожалению, в настоящее время отечественные производители тест-систем выпускают панели контрольных сывороток
исключительно для внутрилабораторного контроля и внешней оценки качества исследований социально-значимых заболеваний (ВИЧ, гепатиты и т. п.). Лишь ограниченное число компаний (например, ООО ・・НПО ・・Диагностические системы・・, г. Нижний Новгород; ・・SeraCare・・, США) на коммерческой основе производят контрольные материалы для контроля качества серологической диагностики заболеваний."

 

[Ирина]

«Повторное замораживание и размораживание сывороток не рекомендуется, поэтому количество сыворотки в аликвоте должно быть достаточным для проведения одного цикла измерений. Правила проведения вну-
трилабораторного контроля качества с использованием контрольных материаловописаны в ГОСТ Р 53133.2–2008.»

«Внешняя оценка качества включает объективную проверку результатов работы лаборатории, осуществляемую периодически внешней организацией. В России — это Федеральная система внешней оценки качества лабораторных исследований (ФСВОК). ФСВОК оказывает помощь КДЛ в обеспечении качества выполняемых исследований посредством предоставления информации о правильности результатов исследования контрольных образцов, рекомендаций по устранению источников выявляемых ошибок и совершенствованию используемых тестов. К сожалению, до настоящего времени лабораторные исследования по диагностике КЭ, ИКБ, эрлихиозов не контролируются ФСВОК.»

«Постаналитический этап. Ошибки постаналитического этапа (до 20 и даже до 45 %) могут быть обусловлены неправильным вводом данных и ошибкой при записи данных от руки, несообщением результатов или передачей результатов не тому адресату, не сообщением или задержкой сведений о критических значениях и т. п.; однако наибольшую опасность представляет ошибочная валидация или неверная интерпретация результатов анализа (Plebani, 2010). В связи с этим критически важное значение имеет понимание врачом клинической информативности лабораторного теста, то есть способности теста выявлять различия в уровне содержания тех или иных маркеров заболевания у больных и здоровых людей.»

«Безусловно, лучшее подтверждение активности инфекционного процесса и, как следствие, предполагаемого диагноза — выявление сероконверсии специфических IgM на IgG и/или не менее чем 4-кратного нарастания титров антител в парных сыворотках; однако такие закономерности удается установить не всегда (раздел 7.3.4, 7.3.5) и в любом случае лишь на более поздних сроках заболевания.»

«Поскольку в клинической практике используют лабораторные тесты, чувствительность и специфичность которых ниже 100 %, вероятность наличия заболевания при использовании только одного теста определяется как не очень высокая
и не очень низкая, предположим, между 10 и 90 % (Флэтчер и др., 1998, С. 89). Получив такой результат, врач может применить дополнительные тесты, которые позволят повысить посттестовую вероятность обнаружения заболевания (при
совпадении результатов первичного и дополнительного исследования) или, наоборот, снизить или полностью исключить вероятность данной патологии (при несовпадении результатов первичного и дополнительного исследования).»

«Проблемы стандартизации тестов для диагностики КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ. Лабораторные тесты, используемые при лабораторной диагностике КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ недостаточно стандартизованы, на что указывают многие специалисты»

«Необходимость создания общеевропейской системы внешней оценки качества серологических тестов и автоматических ПЦР систем, независимой от производителей тест-систем, обсуждалась в конце 2011 г. на совещании экспертовпо проблемам заболеваний, передающихся клещами (ECDC, 2011). Не менее
актуально создание такой системы в США и Канаде (Sider et al., 2012). По-видимому, и в России необходимо рассмотреть вопрос о создании системы контроля качества измерений при лабораторной диагностике заболеваний, передающихся иксодовыми клещами. Для этого надо разработать панель контрольных материалов, как это сделано, например, в Германии (Muller et al., 2012), и предусмотреть возможность включения разработанной панели в Федеральную систему внешней оценки качества.»

«Существенным условием для независимой оценки и стандартизации существующих и новых тестов могла бы стать реализация идеи о создании биобанка материаловВ него должны войти биоматериалы от больных КЭ, ИКБ, ГАЧ или МЭЧ с подробно описанными клиническими проявлениями, а также от хорошо охарактеризованных пациентов с другими заболеваниями. Исследование таких биоматериалов, в том числе собранных в различных географических регионах, позволит, в частности, установить региональные уровни серопозитивности, которые необходимо учи-
тывать при рациональной разработке серологических тестов; в последующем такие материалы могут использоваться при проведении сероэпидемиологических и молекулярно-биологических исследований.»

«Темнопольная микроскопия витальных препаратов (ИКБ). Темнопольная микроскопия (ТПМ) — это вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом, при этом удается зарегистрировать даже незначительные различия в преломляющей способности участков препарата. Метод ТПМ широко применяется для определения спонтанной инфицированности клещей боррелиями (см. разделы 3.4.2; 3.4.4), изучения вертикальной и горизонтальной передачи боррелий (раздел 3.4.3), контроля накопления возбудителя в культуре (Aguero-Rosenfeld et al., 2005), а также для обоснования назначения предупредительной антибиотикотерапии в случае выявления боррелий в клеще, снятом с покусанного человека (см. раздел 8.3). Отрицательный результат микроскопических исследований не исключает присутствия боррелий в организме пациента.»

«Исследование клещей в принципе возможно (см. раздел 4.2.1), однако в любом случае по результатам микроскопии мазков невозможно определить видовую принадлежность возбудителей и оценить их патогенность для человека.»

«Культивирование боррелий. Для выделения боррелий используют материалы от больных людей (кровь, ликвор, лимфа, внутрисуставная жидкость, биоптаты тканей и др.), иксодовых клещей, грызунов. Боррелии чрезвычайно требователь-
ны к условиям культивирования. Оптимальной питательной средой для изоляции и культивирования возбудителей ИКБ является модифицированная среда Barbour-Stoenner-Kelly — BSK-II (раздел 3.2.1). Для успешного выделения возбуди-телей необходимо использовать биологический материал, собранный на ранних стадиях заболевания до начала антибиотикотерапии. Взятие материала должно осуществляться в стерильных условиях с последующей быстрой доставкой в микробиологическую лабораторию и помещением в питательную среду.»
«Из кожных биоптатов, взятых в области мигрирующей эритемы (МЭ) у нелеченных пациентов, не менее чем в 40 % случаев удается изолировать боррелии; при хроническом атрофирующем акродерматите и боррелиальной лимфо-
цитоме процент положительных результатов от 22 % и выше. Существенно реже удается выделить боррелии из цельной крови или ее компонентов (сыворотка, плазма), что может быть обусловлено низким уровнем спирохетемии (примерно 0,1 культивируемая клетка/мл цельной крови) у некоторых пациентов»
«Методы прямой детекции возбудителей КЭ, ИКБ, ГАЧ или МЭЧ — ≪золотой стандарт≫ лабораторной диагностики и могут быть использованы для подтверждения острой стадии заболевания, изучения динамики хронизации болезни,
контроля эффективности лечения.
Преимущества: успешное выделение возбудителя из клинического материала по-
зволяет подтвердить этиологию заболевания на ранних сроках до появления специфических антител и идентифицировать возбудитель; обеспечивает возможность специфической профилактики (КЭ) или предупредительной терапии (ИКБ, ГАЧ, МЭЧ) на основе выявления возбудителя в клещах, снятых с покусанных пациентов.
Недостатки: длительность, трудоемкость, необходимость соблюдения противоэпидемического режима, необходимость подготовки высококвалифицированного персонала для постановки и учета результатов микроскопического исследо-
вания и культивирования.»
«Серологическая диагностика
Материалом для выявления специфических антител при серологической диагностике КЭ, ИКБ, ГАЧ и МЭЧ являются сыворотки крови (и/или СМЖ), собранные в начале заболевания и в стадии реконвалесценции. При исследовании этих
материалов необходимо соблюдать правила, установленные для работы с вирусом клещевого энцефалита, так как в пробах крови может присутствовать возбудитель КЭ или другой инфекции.Для установления факта нарастания титров исследование сывороток необходимо проводить в одном опыте; в связи с этим все пробы крови больного сохра-няют до конца периода обследования при температуре –20 °С и ниже.»
«Иксодовые клещевые боррелиозы. нРИФ была разработана одной из первых и предложена в клиническую практику для диагностики заболеваний группы ИКБ. До настоящего времени этот тест используется, в том числе и в России (Ко-
ренберг и др., 2000; Алыпова и др., 2002), однако постепенно уступает место более простому, быстрому, высокопроизводительному и менее трудоемкому методу иммуноферментного анализа»
«Несмотря на высокую межлабораторную вариабельность результатов вследствие использования разных штаммов возбудителя и нестандартизованности культуральных антигенов, использование нРИФ для скрининга сывороток от боль-
ных людей считают перспективным (Magnarelli et al., 1998).»
«Иммуноферментный анализ (ИФА)
Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) наиболее часто используют для серологического подтверждения в остром периоде заболевания, вызванноговозбудителями КЭ, ИКБ, ГАЧ и МЭЧ. Метод ИФА позволяет подтвердить диагноз КЭ уже на 4–5-й день заболевания на основе однократного выявления антителкласса М;»
«При серодиагностике ИКБ в тестах первого поколения в качестве источника антигена для выявления IgG и IgM антител (раздельно или в комбинации) использовали цельноклеточные антигены боррелий, обработанные ультразвуком
(или лизаты после обработки детергентами). Позже начали применять выделен-ную из боррелий фракцию белков-антигенов или очищенный флагеллин, что позволило снизить уровень перекрестных иммунологических реакций (Coleman, Benach, 1987; Hansen et al., 1988). В современных тестах третьего поколения используют различные комбинации высокоспецифичных иммунодоминантных белков боррелий или их полипептидных фрагментов, не содержащих участков аминокислотной цепи, гомологичных антигенным детерминантам других микроорганизмов (Aguero-Rosenfeld et al., 2005; Wilske et al., 2007).»
«Для серологической диагностики ИКБ выбор оптимальной композиции антигенов важен критически. Это связано со сложностью антигенной структуры боррелий, способностью некоторых антигенов к дифференциальной экспрессии
в организме переносчика и хозяина (Schwan et al., 1995; Gilmore et al., 1999; Schwan, Piesman, 2002; Aguero-Rosenfeld et al., 2005; Aguero-Rosenfeld, 2011), а некоторых к исключительной экспрессии in vivo в организме инфицированного млекопитающего хозяина (Das et al., 1997; Fikrig et al., 2000), антигенными различиями междугеновидамиBorrelia burgdorferi sensu lato (Jauris-Heipke et al., 1993; Theisen et al., 1993; Roessler et al., 1997; Hauser et al., 1998а; Stanek, Reiter, 2011).»

 

[Ирина]

"В России для лабораторной диагностики ИКБ используют отечественные тест-системы компаний ・・Омникс・・ (Санкт-Петербург) и ・・Вектор-Бест・・ (Новосибирск), построенные на основе рекомбинантных иммунодоминантных белков боррелий (см. табл. 7.10). Продемонстрирована эффективность их применения в условиях клинико-диагностической лаборатории при серологической верификации ИКБ (Фризен и др., 2004, 2005)."

"К 2010 году только в США зарегистрировано около 80 коммерческих тестов (FDA, 2010), однако проблема их стандартизации остается по-прежнему актуальной (раздел 7.1.3)."

"Иммуноблот.
Иммуноблот в основном используют для подтверждения специфичности антител, обнаруженных более простыми серологическими методами (см. раздел 7.3.4). Его применение в качестве единственного диагностического теста не рекомендуется. Это связано с существенным снижением специфичности серологического исследования, которое базируется исключительно на иммуноблоте (Engstrom et al., 1995; Johnson et al., 1996, 2011), и более низкой (по сравнению с ИФА) чувствительностью этого метода на ранних стадиях заболевания (Ledue et al., 1996; Aguero-Rosenfeld
et al., 1996; Trevejo et al., 1999; Wormser et al., 2008; Ang et al., 2011), что может приводить к получению ложноотрицательных результатов (Tylewska-Wierzbanowska et al., 2002; Bacon et al., 2003). Сероконверсию при исследовании более поздних проб также не всегда удается выявить этим методом, поскольку лечение антибиотиками
может влиять на иммунный ответ к боррелиям (Aguero-Rosenfeld et al., 1996)."

"Применение иммуноблота при заболеваниях группы ИКБ. Иммуноблот позволяет определить спектр специфических
антител, синтезируемых у обследованного больного к различным антигенам боррелий, и может быть построен на основе нативных цельноклеточных лизатов или рекомбинантных антигенов.
В иммуноблоте на основе нативных антигенов, как правило, используют ультразвуковой сонификат, полученный из чистых штаммовых культур одного из видов B. burgdorferi sensu lato.
Основной недостаток данного вида иммуноблота —присутствие в нем, кроме высокоспецифичных антигенов боррелий, ряда низкоспецифичных белков, которые могут существенно осложнить интерпретацию результатов тестирования из-
за наличия перекрестных реакций. Для надежной идентификации белков в каждой из полос электрофореграммы используют моноклональные антитела к иммунодо-минантным белкам боррелий. Однако вариабельность иммунодоминантных антигенов боррелий, патогенных для человека, значительно ограничивает использова-
ние иммуноблотов на основе нативных антигенов для диагностики заболеваний группы болезни Лайма."

"Линейный иммуноблот (line immunoblot). Чувствительность иммуноблота на основе рекомбинантных антигенов
значительно улучшается (без потери специфичности) благодаря использованию дополнительных антигенов и разработке линейных иммуноблотов (Wilske et al., 1999б; Schulte-Spechtel et al., 2003; Goettneret al., 2005). Принципиальные отличия лайн-иммуноблота от описанных выше вариантов состоял в том, что каждый антиген
наносится на мембрану в виде отдельной полосы."


"Интерпретация результатов иммуноблота. В США для интерпретации результатов иммуноблота спользуют рек. СDC.
Результат иммуноблота для определения IgM следует считать положительным, если в нем выявляется не менее двух из трех полос антигенов (Engstrom et al., 1995): 24 kDa (OspC —молекулярный вес варьирует), 39 kDa (BmpA) и 41 kDa (Fla); при выявлении IgG в положительном варианте ответа должны выявляться не менее пяти из 10 полос, соответствующих следующим антигенам (Dressler et al., 1993): 18 kDa, 21 kDa (OspC), 28 kDa, 30 kDa, 39 kDa (BmpA), 41 kDa (Fla), 45 kDa, 58 kDa (не GroEL), 66 kDa и 93 kDa."


"Однако американские критерии нельзя применять в Европе (Hauser et al., 1997, 1998б; Robertson et al., 2000) и в России. Это связано с тем, что иммунный ответ у европейских пациентов развивается в большинстве случаев к иным, чем в США."


"Таким образом, даже с помощью новых рекомбинантных иммуноблотов полностью стандартизовать иммуноблот не уда-
лось (Wilske et al., 1999б), особенно в отношении рекомбинантного IgM иммуно-
блота (Strle, Stanek, 2009)."


"Специфичность, чувствительность, ограничения и практическая целесообразность различных серологических методов.
Чувствительность. При оценке чувствительности серологического исследования необходимо принимать во внимания
необходимо принимать во внимание срок обследования больного от начала заболевания, особенности клинического течения болезни, возможность наличия у больного специфического иммунитета, сформировавшегося в процессе естест-
венной или искусственной (вакцинация, введение специфического гамма-глобулина против вируса КЭ) иммунизации, но оказавшегося по тем или иным причинам недостаточно напряженным для предотвращения заболевания, введение
с лечебной целью лекарственных препаратов, влияющих на функцию иммунной системы (Кветкова, 1984; Погодина и др., 1986; Леонова, 1997; Иерусалимский, 2001; Holzmann, 2003), или раннего начала антибиотикотерапии (Shrestha et al., 1985; Dattwyler et al., 1988; Berardi et al., 1988; Ismail et al., 2010), а также возможное влияние смешанной инфекции на развитие гуморального иммунного ответа (Якушева, 2003; Субботин и др., 2012); ложноотрицательные результаты могут быть также следствием недостаточной чувствительности и плохой стандартизации тест-систем."

 

[Ирина]

"При ИКБ на ранней стадии болезни все серологические методы недостаточно чувствительны и только в 20–0 % случаев выявляют IgM (преимущественно) и (или) IgG (Asbrink et al., 1985; Weber et al., 1990; Hansen, Asbrink, 1989);
аналогичные закономерности установлены и при исследовании российскихбольных ИКБ."

"Представление о более высокой чувствительности, но меньшей специфичности ИФА (и нРИФ) по сравнению с иммуноблотом, положено в основу двухступенчатого алгоритма диагностики заболеваний группы ИКБ (см. ниже) в США
и европейских странах (CDC, 1995; Wilske et al., 2000; Christova, 2003; Brouqui et al., 2004; Skocir et al., 2008). Вместе с тем имеются данные, свидетельствующие об одинаковой (Panelius et al., 2001; Chmielewska-Badora et al., 2006) или даже более высокой чувствительности иммуноблота по сравнению с ИФА и нРИФ (Ruzic-Sabljic et al., 2002; Strle, Stanek, 2009; Wojciechowska-Koszko et al., 2011; Aberer, Schwantzer, 2012), в том числе на ранних сроках заболевания (Aguero-Rosenfeld et al., 1996), а специфичность IgM иммуноблота может быть низкой, всего лишь около 70 % (Seriburi et al., 2011)."

"Для повышения специфичности серологической диагностики, особенно с учетом возможного микст-инфицирования, в исследование целесообразно включать антигены родственных возбудителей (и других возбудителей, которые могут пе-
редаваться при укусе клеща), а также использовать процедуру предварительного истощения сывороток и подтверждающего тестирования в иммуноблоте; наиболее перспективный современный подход —использование различных комбинаций высокоспецифичных иммунодоминантных белков возбудителей или их полипептидных фрагментов, не содержащих участков аминокислотной цепи, гомологичных антигенным детерминантам других микроорганизмов. Важный фактор повышения специфичности —стандартизация тест-систем и контроль качества исследований (см. раздел 7.1.3)."

"Ограничения серологических тестов. Даже чувствительные и специфичные серологические тесты, применяемые в
・・правильные・・ периоды заболевания, не всегда позволяют подтвердить клинический диагноз. Возможные причины ложноотрицательных и ложноположительных результатов перечислены в разделе 7.1.1. В целом серологические результаты могут существенно варьировать, а антитела персистировать даже у успешно леченых пациентов (Dumler et al., 2007; Strle, Stanek, 2009; Удинцева, 2010). До недавнего времени снижение уровня специфических IgG к пептиду С6 рассматривалось в качестве индикатора успешной терапии (Philipp et al., 2003), однако это не было подтверждено"

"Практическая целесообразность различных серологических тестов. Клинико-диагностическая лаборатория
может опираться только на такие методы, которые не требуют уникального оборудования, регулярно воспроизводимы, обеспечены доступными реагентами и позволяют оперативно исследовать большое число проб (Гайдамович, 1982). С учетом этого каждый из серологических методов (нРИФ, ИФА, иммуноблот), который может быть использован для подтверждения заболеваний, передающихся иксодовыми клещами, имеет свои преимущества и недостатки (табл. 7.11)."

"Как отмечено ранее (раздел 7.1.2), сочетание ИФА или (реже) нРИФ с иммуноблотом лежит в основе двухступенчатой процедуры тестирования, используемой в США и в ряде европейских стран для диагностики заболеваний группы ИКБ
(CDC, 1995; Wilske et al., 2000). Центр по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) рекомендует такой подход как для обследования индивидуальных пациентов (CDC, 1995), так и для эпидемиологического надзора за этим заболева-
нием (CDC, 1997); двухступенчатый подход рекомендован также для подтверждения диагноза болезни Лайма у пациентов, имеющих отличные от мигрирующей эритемы проявления заболевания (Wormser et al., 2006)."

"...считают, что иммуноблот нельзя использовать в качестве подтверждающего теста, поскольку ИФА и иммуноблот
включают разный набор антигенов, что может привести к получению различающихся результатов при обследовании конкретного больного, даже если в целом между используемыми тестами (ИФА и иммуноблот) наблюдается высокаякорреляция (Smismans et al., 2006). Другой аргумент ・・против・・: отсутствие единых критериев интерпретации данных и недостаточная стандартизация серологических методов (раздел 7.1.3), прежде всего иммуноблота (раздел 7.3.3), может приводить к получению как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов и невозможности сопоставления результатов тестирования в различных лабораториях"

"Вследствие этого значительное число больных остается не диагностированными и не получают необходимого лечения
(ILADS, 2004), либо, наоборот, получают ненужную терапию (Seriburi et al., 2011). Перспективы совершенствования подходов к лабораторной диагностике болезни Лайма, предложенные недавно Институтом медицины США (IOM, 2011),
включают оценку клинической эффективности тестов на основе пептида С6 в качестве альтернативы двухступенчатой процедуре тестирования."

"Другой подход —разработка мультиплексных тестов, сочетающих высокую чувствительность ИФА и специфичность иммуноблота и обеспечивающих на этой основе повышение надежности серологического тестирования (IOM, 2011; раздел 7.5.4). Применительно к лабораторной диагностике заболеваний группы ИКБ наиболее эффективной может оказаться комбинация этих подходов, включающая использование пептида С6 в сочетании с другими пептидными и рекомбинантными антигенами боррелий для построения мульти-аналитных систем (Помелова и др., 2009б, 2010в, 2013; Porwancher et al., 2011)."

"Однако независимо от успехов в разработке новых антигенных препаратов и тест-систем, к настоящему времени так и не удалось выявить специфический биомаркер, позволяющий при однократном тестировании различать активную
форму инфекции от перенесенного ранее заболевания и реинфекции (Cameron, 1999; Cetin et al., 2006; Nadelman, Wormser, 2007; Steere et al., 2008). Поэтому лабораторное подтверждение активного инфекционного процесса, обусловленного В.в, (и другими инфекциями передаваемыми иксодовыми клещами) должно базироваться на
обследовании парных сывороток, собранных от пациентов на разных сроках с использованием чувствительных
и специфичных иммуноферментных тест-систем нового поколения"


Интерпретация результатов серологической диагностики

"Отрицательный результат выявления специфических антител не исключает инфицирования возбудителями КЭ, ИКБ, ГАЧ или МЭЧ (см. разделы 3.7, 7.1.1, 7.3.4, 7.4.2) и требует повторного обследования сывороток, собранных на бо-
лее поздних сроках. В ряде случаев может оказаться полезным дополнительное исследование проб крови от серонегативных пациентов в ПЦР с праймерами, обеспечивающими амплификацию специфической РНК или ДНК возбудителей, а также выделение возбудителя (Grignolo et al., 2001; Coulter et al., 2005; Тетерин
и др., 2010, 2012), установление факта антигенемии (Леонова, Майстровская, 1996; Леонова и др., 1996), определение цитокинового статуса пациента (Леонова, Крылова, 2012)."

"У здоровых людей серопозитивность нарастает с возрастом и зависит от длительности пребывания на природе
(см. разделы 2.5.3, 3.5.2, 4.5; Reimer et al., 1999; Иерусалимский, 2001; Cetin et al., 2006; Dumler et al., 2007; Grzeszczuk et al., 2007 и др.). Первоначально наличие выраженного иммунного ответа на антигены VlsE и С6 рассматривалось в качестве маркера активной инфекции, вызванной В.в
Однако в настоящее время установлено, что антитела к этим антигенам могут быть выявлены также у выздоравливающих и здоровых людей, что не позволяет дифференцировать текущую и прошлую инфекцию (Strle, Stanek, 2009)."

"Стабильный титр специфических антител во всех пробах крови больного, взятых в разные сроки от начала болезни, не является достоверным свидетельством для подтверждения или исключения клинического диагноза. При этом предсказательная ценность положительного результата (см. раздел 7.1.3) тем ниже, чем менее выражена клиническая симптоматика"


Детекция антигенов или нуклеиновой кислоты возбудителя

Молекулярные методы детекции (ПЦР)

"Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод ферментативного получения ампликонов.
(большого количества копий) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити); при этом происходит копирование только исследуемого участка
ДНК (при условии его присутствия в исследуемом образце), поскольку только этот участок соответствует заданным условиям."

"Детекция ДНК B. burgdorferi sensu lato. Возможность применения ПЦР для
изучения патогенеза заболеваний группы болезни Лайма, передачи возбудителя
и его биологии впервые показана в 1989 году (Rosa, Schwan, 1989).
особенности постановки ПЦР для выявления ДНК B. burgdorferi sensu lato под-
робно описаны в обзорах B. Schmidt (1997) и Y. Yamamoto (2002). Установлено,
что чувствительность и специфичность этого метода зависят от выбора ДНК-
мишени (матрицы), последовательностей праймеров, методики постановки ПЦР
и детекции продуктов амплификации, процедуры экстракции ДНК. Критические
факторы для достижения максимальной чувствительности и специфичности
ПЦР при детекции ДНК B. burgdorferi sensu lato — выбор генов-мишеней и дизайн
олигонуклеотидных праймеров, а также методика проведения реакции."


"Хотя теоретически чувствительность метода ПЦР очень высока (до 10 микробных клеток в пробе), однако при исследовании клинических образцов она часто оказывается недостаточной (Holzmann, 2003; Aguero-Rosenfeld et al., 2005; Santino et al., 2008; Eshoo et al., 2012). Помимо причин методического характера, негативно влияющих на уровень чувствительности (например потери ДНК при экстракции, присутствие в пробе ингибиторов, деградация ДНК при транспортировке и хранении и т. п.), существуют и объективные факторы, прежде всего обусловленные низкой концентрацией возбудителей (например в случае боррелий —не выше 50 клеток/мл) в инфицированных тканях и жидкостях пациентов (Goodman et al., 1991; Schwaiger et al., 2001; Liveris et al., 2002)."

"В настоящее время метод ПЦР рассматривают как дополнительный к серологии перспективный метод (Oksi et al., 1995; Lee et al., 2010а, б; Тетерин и др., 2010; и др.). Его применение особенно целесообразно на ранней серонегативной стадии заболевания до получения регистрируемого серологического ответа, а также в случаях, когда серологические методы дают неубедительные результаты (Childs et al., 1999; Dumler et al., 2007; Thomas et al., 2009; Schwarzova et al., 2009; Eshoo et al., 2012). Однократное тестирование методом ПЦР (в случае положительного результата) рассматривают как однозначное подтверждение этиологии инфекции, не требующее повторного визита к врачу (Brouqui et al., 2004; Eshoo et al., 2012). С учетом этого чрезвычайно важно принимать во внимание эффективность методов ПЦР и серологического тестирования на разных сроках заболеваний,
Недостатки в применении ПЦР и технологии прямого автоматического секвенирования связаны с высокой стоимостью подготовки проб и очистки ДНК, а также с необходимостью подготовки высококвалифицированного персонала для постановки и учета результатов ПЦР. В целом метод ПЦР недостаточно стандартизован и находится в стадии разработки (Nolte, 2012; и др.). Необходима стандартизация методов прямого выделения ДНК и включение подходящих групп пациентов для оценки чувствительности и специфичности этого метода
(Cerar et al., 2008). Отсутствие коммерческих тестов стандартного качества является одной из причин, почему ОТ-ПЦР до сих пор широко не используется длялабораторной диагностики КЭ (Donoso-Mantke et al., 2007а)."

 

[Ирина]

"Ограничения: отрицательный результат ПЦР не исключает диагноза КЭ, ИКБ
ГАЧ или МЭЧ, поскольку в острой стадии этих заболеваний период циркуляции возбудителей в крови больного непродолжителен, а эффективность выявления РНК/ДНК методом ПЦР напрямую зависит от концентрации возбудителя
и срока от начала заболевания. Положительный результат ПЦР свидетельствует о факте инфицирования пациента, однако не может служить однозначным подтверждением активности инфекционного процесса (Stanek et al., 2011), поскольку
возможно выявление нуклеиновой кислоты как жизнеспособных, так и утративших инфекционный потенциал возбудителей."

Проблемы оценки положительных результатов

"Широчайший интерес к природноочаговым зоонозам, к их эпизоотологии и эпидемиологии, вызванный открытием многих неизвестных ранее возбудителей и нарастающей интенсивностью эпидемических проявлений природных оча-
гов, совпал с расширением арсенала современных молекулярно-биологических методов, применяющихся сейчас для их изучения и диагностики."

"ДНК-ДНК гибридизация, плазмидный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее модификации, включая ПЦР в режиме реального времени, полиморфизм длины фрагментов рестрикции (ПЦР-ПДРФ), анализ числа вариабельных локусных тандемных повторов (MLVA —multiple locus variable number tandem repeats analysis), секвенирование генома или, чаще, его различных участков, мультилокусный сиквенс анализ (MLSA или МЛСА) и другие молекулярно-биологические методы, несомненно, открыли совершенно новые возможности для исследования феномена природной очаговости. Их активное применение в этих целях не только в научных исследлованиях, но и в современной практической диагностической работе лабораторий санэпидслужбы и клинических стационаров (Материалы, 2012) —очень отрадное явление. В конечном счете оно выведет изучение паразитарных систем на совершенно другой уровень."

"Вместе с тем приходится констатировать, что появилась некоторая эйфория, основанная на убеждении, что эти методы сами по себе прояснят ключевые проблемы эпизоотологии и эпидемиологии природноочаговых инфекций. Явственно высветились ・・болевые точки・・ и ・・подводные камни・・, возникающие при их применении и недостаточно продуманной трактовке полученных результатов (Коренберг, 2010). Как и в случаях с лекарственными препаратами, это надежду явно или скрыто поддерживают производители различных тест-систем."

"В этой связи уместно напомнить о беспокойстве Н. П. Дубинина (1992, С. 367), выраженном применительно к общим проблемам генетики еще 20 лет назад: ・・Необходимость использования физико-химических и биохимических методов привела к тому, что разрабатывать проблему молекулярной генетики стали ・・чистые・・ биохимики. Это было полезно, но одновременно послужило появлению неправильных суждений о задачах генетики в целом, привело к однобокости в понимании характера значимости работ по общей генетике・・."

"Молекулярно-биологические методы в ситематике и таксономии возбудителей природноочаг. инфекций. Предложены и продолжают обсуждаться критерии отличий нуклеотидных последовательностей
определенных генов и их таксономическое значение, на основе которых описаны новые виды или варианты
возбудителей (Ананьина, Самсонова, 2000; Fournier et al., 2003; Baranton, Postic, 2006; Postic et al., 2007; Fingerle et al., 2008; Kugeler et al., 2008; Rudenko et al., 2009;Schwan et al., 2009; Cutler et al., 2010 и др.)."

"Только за последние годы, благодаря исследованиям, проведенным с использованием молекулярно-биологических методов, описаны такие неизвестные ранее формы, близкие к вирусу Западного Нила, возбудителям риккетсиозов
клещевой группы, эрлихиозов, анаплазмоза, боррелиозов, бартонеллезов, туляремии и др."

"Трудно предугадать, сколько непатогенных и патогенных форм микроорганизмов определенной таксономической группы еще будет вновь описано, и в чем конкретно будет заключаться видоспецифичность структуры их генома. В результате сегодняшний подбор генов для МЛСА с целью описания новых видов уже завтра может оказаться нерезультативным."

"Остановимся на его значении на примере рода Borrelia, который давно известен по спирохетам, экологически связанным с аргасовыми клещами (Argasidae) и вызывающими заболевания группы АКБ. Внутри рода Borrelia существует вторая довольно обширная таксономическая группа боррелий —B. burgdorferi sensu lato, которая экологически связана с иксодовыми клещами (Ixodidae). Часть из них патогенна для человека и вызывает ИКБ.
В 1995 г. в Японии описана B. miyamotoi (Fukunaga et al., 1995). Эта спирохета
привлекает особый интерес исследователей, поскольку она экологически связана с иксодовыми клещами, а по структуре генома значительно ближе к группе боррелий, передающихся аргасовыми клещами (Rich et al., 2001; Bunikis et al., 2004)."

"Вскоре после описания B. miyamotoi, было высказано предположение, что это
представитель самостоятельной филогенетической ветви современных боррелий. Более того, уже тогда стало понятно, что будут описаны новые виды спирохет,
близкие по своим эколого-генетическим характеристикам к B. miyamotoi (Корен
берг, 1996). В дальнейшем так и произошло."


"Помимо B. miyamotoi sensu stricto, в него входят несколько уже известных видов боррелий (B. lonestari, B. barbouri,
B. theileri), которые передаются иксодовыми клещами родов Amblyomma, Boophilus, Rhipicephalus, и, что особенно важно, по всей видимости, ряд пока еще неизвестных видов, патогенных или, скорее непатогенных для человека"

"Настораживает, что не удалось получить на территории нашей страныизолят В.miyamotoi закр. его (сохранить)


2010; Фоменко и др., 2010, 2010а), как это принято в микробиологии, и официаль-
но депонировать в соответствующий музей боррелий. Это полностью исключает
возможность дальнейших всесторонних микробиологических исследований об-
наруженных спирохет, в том числе и современными молекулярно-биологически-ми методами, которые открывают большие возможности."

"Своего рода ・・золотым стандартом・・ микробиологии было, есть и будет наличие изолята, и это ни в коей мере не противоречит необходимости и перспективам применения современных молекулярно-биологических методов (Коренберг и др., 2006)."


"В связи с появлением виртуальных баз данных хорошо известное значение музеев живых культур для изучения микроорганизмов не только не ослабевает, но даже увеличивается. Они дают возможность возвращаться к их анализу или более детальному изучению по мере совершенствования молекулярно-генетических методов. Тем более, что эти методы, открывая исследователям большие возможности, сами по себе не избавляют от риска
лабораторной контаминации, технических погрешностей на разных этапах выделения и изучения нуклеиновых кислот и субъективизма при оценке полученных результатов (Коренберг и др., 2006б; Korenberg et al., 2006)"

 

[Ирина]

"Молекулярно-биологические методы при индикации природных очагов и оценке роли животных в циркуляции
возбудителей. Применение молекулярно-биологических методов открыло большие дополнительные
возможности для выявления самого факта существования различных возбудителей (т. е. природных очагов)на определенной территории."


"Таким образом, достоверность результатов зависит, прежде всего, от специфичности методики исследования, что особенно важно, когда речь идет о микроорганизмах, которые впервые индицированы в данном географическом регионе. Например, для одновременной индикации и идентификации боррелий до комплекса
B. burgdorferi sensu lato наиболее чувст вительный и специфичный молекулярный маркер —fla ген (Wodecka et al., 2010)."

"Бартонеллы, например, — обширная группа близких бактерий-симбионто
млекопитающих. Лишь меньшая часть из них патогенны для человека, но их рас-
пространение еще плохо изучено, и новые достоверные данные по этому поводу представляют большой интерес."

"Кроме того, совершенно ясно, что в ближайшее время будут описаны пока еще неизвестные виды."

"Обнаружение ДНК или РНК того или иного возбудителя у членистоногих или позвоночных все чаще трактуют как достаточный аргумент для признания их переносчиками или резервуарными хозяевами, что совершенно неправомерно. Один из таких типичных примеров —обнаружение кДНК и антигена вируса Западного Нила
у иксодовых клещей (Москвитина и др., 2008). Как признают авторы, полученные ими факты ・・…не дают строгого ответа на вопрос о роли клещей в формировании природного очага этой инфекции・・ (C. 220), но, тем не ме-
нее, считают, что ・・…активная передача ВЗН клещами осуществляется в течение всего сезона их активности・・"

"Боррелий группы B. burgdorferi sensu lato, например, неоднократно детек-
тировали различными методами, включая молекулярно-биологические, у клещей рода Dermacentor"

"Перспективные методы лабораторной диагностики."

"Перспективы в развитии методов лабораторной диагностики заболеваний, передающихся иксодовыми клещами, связаны с совершенствованием традиционных подходов и внедрением принципиально новых технологий. Для повыше-
ния эффективности существующих лабораторных методов важное значение имеют: автоматизация методик культивирования, использование мультилокусной ПЦР для выявления нескольких ДНК-мишеней (IOM, 2011), включение в состав серологических тестов новых рекомбинантных и пептидных антигенов (разделы 7.3.2, 7.3.3, 7.3.4), совершенствование традиционных методик твердофазного иммуноанализа за счет использования люминесцентных методов регистрации сигнала (Помелова и др., 2006а; Burbelo et al., 2010) и проведения иммунореакции в суспензии. Не менее актуальна разработка алгоритмов лабораторной диагностики с использованием комплекса диагностических методов и набора биомаркеров, обеспечивающих диагностическую точность при контролестадии заболевания или длительности инфицирования, а также при прогнозе течения болезни и оценке эффективности терапии (IOM, 2011)."

"Современные тенденции в развитии лабораторных методов связаны с разработкой технологий мультианалитного (мультиплексного) анализа. Мультиплексные системы обеспечивают возможность одновременного обнаружения нескольких маркеров в одной пробе без ее разделения и лежат в основе комплексного подхода к решению широкого спектра задач в области молекулярной диагностики инфекций, связанных с необходимостью определения спектра антител, антигенов или ДНК при проведении скринингово-сероэпидемиологических обследований эндемичных территорий, серологической диагностики заболеваний, специфической индикации и идентификации патогенов."

"При лабораторной диагностике заболеваний, передающихся иксодовыми клещами, такой подход особенно пер-
спективен в связи с возможным микст-инфицированием и возникновением смешанных инфекций после укуса клеща"

"...перспективные технологические платформы: биосенсоры, чип-лаборатории, системы мультиплексного анализа с использованием суспензий микрочастиц или планарных микроэрреев. Их общей и наиболее существенной характеристикой является миниатюризация и возможность совмещения нескольких аналитических систем в формате одного теста.
Биосенсоры представляют собой датчики, в которых имеется чувствительный элемент, выполненный, в зависимости от назначения, из целых клеток животного, растительного или микробного происхождения, их фрагментов, белков (антител, антигенов, ферментов и т. п.). Биосенсоры трансформируют сигнал биоспецифи-ческого взаимодействия в один из физических сигналов (это может быть сигнал люминесценции, магнитного резонанса, электрохимический, гравиметрический и т. п.) с его последующим преобразованием в электрический (потенциометрический) сигнал. Биосенсорные технологии, благодаря высокому быстродействию (отклик датчика на воздействие можно получить через 1– минуты), нашли применение для решения задач по быстрому выявлению аналитов в режиме реального времени, например в процессе изучения биохимической активности клеток при проведении кинетических измерений. Выявление в пробе одновременно нескольких аналитов (мультиплексный анализ) в биосенсорах обеспечивается за счет объединения нескольких сенсоров в один общий датчик, контактирую-
щий с пробой. Известны работы по использованию биосенсоров для детекции биопатогенов —возбудителей инфекционных заболеваний (Cooper et al., 1999; Anderson et al., 2000), в том числе для прямого выявления специфических антигенов
B. burgdorferi sensu stricto в крови пациентов на ранних сроках болезни Лайма"


"Биосенсорное направление, однако, не получило сколь-нибудь значимого применения в лабораторной клинической диагностике из-за высокой стоимости тестирования, низкой производительности, плохой воспроизводимо-
сти результатов и ограниченного срока службы биосенсорных датчиков."

 

[Ирина]

"Чип-лаборатории (Lab-on-a-chip) —это микросистемы из резервуаров с реагентами, микронасосов, датчиков для регистрации сигналов из микрообъемов, в которых осуществляется полный замкнутый многостадийный цикл анализа без вмешательства оператора. Чип-лаборатории рассчитаны на последовательный анализ большого количества микропроб и потенциально способны осуществлять мультиплексный анализ (Jang et al., 2002; Methods.., 2012). Число публикаций по этой проблеме в последние годы заметно возросло, что свидетельствуето проведении активных исследований. Вместе с тем, несмотря на большие объемы финансирования, направляемые на создание чип-лабораторий, и очевидную внешнюю привлекательность этого подхода, обусловленную возможностью проведения операций преаналитического (пробоподготовка) и аналитического этапа в автоматическом режиме с использованием микроколичеств пробы, ощутимого прорыва в этом направлении не произошло. Исследования ведущих биотехно-
логических компаний, по существу, не вышли за стадию создания экспериментальных образцов или ограниченных по объему партий чип-лабораторий. В настоящее время стоимость тестирования на чип-лабораториях в десятки раз выше
стоимости традиционных методов иммунохимического (иммуноферментного, иммунолюминесцентного) анализа."

"Пожалуй, единственным, но важным исключением являются иммунохроматографические тесты (тест-полоски или картриджи из нескольких элементов), которые в определенном смысле можно рассматривать как прототип чип-лабора-
торий. Они включают все необходимые реагенты для преобразования актов биоспецифического взаимодействия в визуальный, магнитный, электрохимический или люминесцентный сигнал и удобны для получения быстрого предварительного ответа (Ярков и др., 2009)."

"Следует подчеркнуть, что ни биосенсоры, ни чип-лаборатории изначально не были ориентированы на решение задач тестирования биопроб на наличие множества маркеров различных заболеваний. Их диагностический потенциал существенно ниже, чем у биочипов (микроэрреев), развитие которых в последние годы происходит высокими темпами, о чем свидетельствует многократное возрастание числа публикаций."

"В чем преимущество мультиплексных систем по сравнению с традиционными методами биологического микроанализа, и почему так активно ведется их разработка? Прежде всего стало очевидным, что для уточнения диагноза большинства заболеваний целесообразно использовать несколько маркеров, сочетание которых дает более полную и объективную картину болезни. Более того, многие заболевания имеют схожую клиническую картину, что обусловливает необходимость проведения анализа в отношении целого спектра маркеров нескольких заболеваний. Следует также отметить, что мультиплексные миниатюрные аналитические системы, совмещенные в единый тест, обеспечивают кардинальное снижение трудоемкости и материальных затрат на тестирование."

"Технология мультиплексного анализа (технология биочипов или микроэрреев —microarray technology), эволюционировала из Саузерн-блота, в котором фрагменты ДНК, связанные с поверхностью матрикса, выявляются с помощью комплементарных ДНК-зондов. Миниатюризированные ДНК-микроэрреи (ДНК-чипы) готовятся на основе олигонуклеотидов, кДНК или небольших фрагментов продуктов ПЦР, позволяющих контролировать накопление мРНК в биоматериале. Такие зонды синтезируют предварительно, а затем печатают с помощью роботизированных систем (наноплоттеров) на поверхности твердого матрикса (spotted microarrays), либо синтезируют короткие олигонуклеотидные
последовательности из 25–0 оснований непосредственно на поверхности подложки (oligonucleotide microarrays)."

"Благодаря развитию технологий ДНК-чипов происходит формирование новых лечебно-диагностических технологий персонализированной медицины, которые позволяют на генетическом уровне прогнозировать реакцию организма на введение лекарственных веществ (фармакогенетика) и осуществлять индивидуальный для каждого пациента подбор антибиотиков с учетом профиля антибиотикоустойчивости инфекционных агентов"

"Одна из первых основополагающих работ по созданию мультиплексных микро-аналитических систем (биочипов, микроэрреев) для лабораторной клинической диагностики —это работа R. P. Ekins (1989). В ней проанализированы тенденции развития различных методов, основанных на биоспецифическом связывании аналитов с лигандами, и на теоретическом уровне обоснованы высокие аналитические характеристики мультиплексных систем. В частности, была обоснована и экспериментально подтверждена возможность количественного измерения аналитов в микрозонах (эрреях), формируемых в виде массивов микропятен на твердой подложке и дост. чувствительности тестов на уровне
10–15–10–18 М (104–105 молекул аналитов в анализируемой пробе).
аналитов в анализируемой пробе). Впоследствии эти выводы были подтверждены работами многих исследователей вне зависимости от того, на каком физическом принципе осуществлялось детектирование сигнала от микроэрреев."

"Системы мультиплексного анализа могут быть условно разделены на 2 основных вида: планарные и суспензионные на основе микрочастиц (Ellington et al., 2010). В двухмерных планарных системах микропятна связывающих реагентов (олиго-нуклеотидные зонды, рекомбинантные или пептидные антигены, антитела) напечатаны на плоской поверхности в определенном порядке и пространственно разнесены. Идентификация аналита базируется на определении его ・・Х・・, ・・У・・ координат с помощью программных средств обработки сигналов отдельных микропятен. В суспензионном анализе аналиты связываются на поверхности частицы с лигандами и выявляются по наличию сигнала флуоресценции, обусловленного комплексом биореагентов с флуоресцентной меткой."

"В настоящее время в клинической практике наибольшее применение нашла мультиплексная технология ЛюминексR на основе суспензионного анализа. Для одновременного выявления нескольких аналитов исполь-
зуют смесь из частиц (диаметром 5– микрон), отличающихся спектрами собственной флуоресценции."

"Технология ЛюминексR теоретически рассчитана на одновременное детектирование до 100 аналитов, а при тестировании ДНК —до 500 олигонуклеотидов. Преимущества суспензионной системы обусловлены хорошей воспроизводимостью результатов, поскольку заключение о наличии искомого аналита выдается на основе 50–00 независимых измерений каждого ・・сорта・・ микрочастиц."

"・・ИММУНОСКРИН・・ (Москва) предложен вариант формирования адреса на основе длительно люминесцирующих соединений. В этом варианте считывание сигнала осуществляется на твердой нелюминесцирующей мембранной подложке после стадии промывки, а формирование адреса частиц осуществляется с учетом не только спектральных, но и временных характеристик затухания фосфоресценции (Oсин, 2010). Применение штрих-кодировки и у с учетом дополнительных параметров флуоресценции, таких как кинетика затухания флуорохромов, теоретически позволяют
существенно расширить мультиплексность и динамический диапазон выявляемых концентраций суспензионных методов и более надежно формировать ・・адрес・・ микрочастиц. Эти разработки, однако, появились существенно позже, чем технология ЛюминексR, и не достигли сколь-нибудь заметного уровня коммерциализации."

"Биочипы, в которых в качестве лигандов используются антитела для выявления аналитов или антигены для выявления антител, получили название иммуночипов. Большинство задач в области лабораторной диагностики, в том числе природноочаговых инфекций, с использованием иммуночипов может быть
ограничено небольшим (до нескольких десятков) числом микроэрреев."

"Для регистрации сигнала с поверхности биочипа апробированы различные системы электрического, электрохимического, магнитного и оптического детектирования. Сегодня практически весь рынок биочипов (более 90 %) сформирован на основе оптических систем детекции. Последние можно разбить на две группы: микроэрреи с фотометрической системой детекции (измерение оптической плотности пятен) и микроэрреи с люминесцентной системой детекции (измерение сигнала флуоресценции, фосфоресценции или усиленной хемилюминесценции)."

"Фотометрическая система детекции используется в сочетании с иммуноферментным анализом и проявляющими реагентами на основе нерастворимых субстратов (например, солей тетраметилбензидина). Эта система не требует дорого-стоящего оборудования для регистрации сигнала (может быть использован даже обычный копировальный сканер). Фотометрическая система детекции проста, и ее использование целесообразно, когда не требуется высокая чувствительность и точность тестирования."

"Люминесцентные системы детекции сложнее. В настоящее время они доминируют на рынке биочипов. Это обусловлено тем, что биочипы с люминесцентной детекцией способны обеспечить ・・рекордную・・ чувствительность (до тысячи мо-лекул аналита в анализируемой пробе), широкий диапазон выявляемых концентраций аналитов (не менее 4– порядков) и приемлемую точность с коэффициентом вариации на уровне до 10–2 %."

"Белковые иммуночипы, как правило, основаны на использовании сэндвич-формата иммуноанализа. Такой формат обеспечивает высокую чувствительность и специфичность. Критическим фактором, ограничивающим мультиплексность,
является специфичность белков, сорбированных на подложке (MacBeath, 2002), и их связывающая аффинность (Templin et al., 2003; Seurynck-Servoss et al., 2007)."

"Создание высокоплотных иммуночипов связано с объективными сложностями.
Ключевые из них:
—выбор подходящей поверхности и методов пришивки, обеспечивающих поддержание вторичной и четвертичной структуры белков, а значит и их биологической активности и способности к взаимодействию с другими молекулами;
—масштабирование производства стабильных эрреев, сохраняющих активности при хранении;
—идентификация и выделение антител или других связывающих молекул к каждому белку генома человека;
—количественный учет уровня связанных белков при оценке чувствительности и предотвращение фонового ・・шума・・;
—экстракция детектируемого белка из чипа для его последующего анализа;
—снижение неспецифического связывания улавливающими реагентами;
—потенциал чипа, который должен быть достаточным для максимально возможной презентации генома: белки, накапливающиеся в больших количествах, маскируют детекцию белков, накапливающихся в меньших количествах (сиг-
нальные молекулы и рецепторы), которые обычно представляют наибольший терапевтический интерес."

"В нашей стране компанией ООО ・・Биочип-ИМБ・・ (Москва) зарегистрирован иммуночип для выявления 6 онкомаркеров (Саватеева и др., 2006), в стадии разработки и регистрации находятся иммуночипы компании ООО ・・Интерлабсервис・・ (Москва) для серодиагностики инфекций группы ТОРЧ–комплекса. Этот список в ближайшие 3– 5 лет будет многократно расширен за счет создания диагностических иммуночипов
низкой плотности, предназначенных, в основном, для качественных и полуколичественных измерений."

"Аппаратурно-методическое оснащение мультиплексного анализа
По мере формирования рынка иммуночипов все большее внимание привлекает микропланшетный формат, которому мы уделим особое внимание. По сравнению со слайдами этот формат экономичен, обеспечивает гораздо большую производительность и может быть использован для массовых скрининговых обследований населения."

"Ряд ведущих мировых компаний выпускает специализированные принтеры (наноплоттеры) для контактной и бесконтактной печати эрреев в лунки микропланшетов (Arrayjet AJ120, Aushon Biosystems 2470, Bio-Rad BioOdyssey Calligrapher, Genetix Qarray2, Genetix QArray mini, Lab Next Thomas™ PerkinElmer Piezzoarray, Scienion sciFlexarrayer, Telechem Nanoprint™ Biodot AirJet). Контактные принтеры проще в эксплуатации и обеспечивают более высокую производительность, однако вариабельность дозирования у них выше и, соответственно, биочипы имеют более
высокий коэффициент вариации люминесцентных сигналов."

"Микропланшетный формат предполагает точное дозирование объема пробы в лунки микропланшета и обеспечивает существенно более высокую точность при количественных и полуколичественных измерениях концентраций аналитов. Следует отметить, что внедрение микропланшетных биочипов в практику клини-
ко-диагностических лабораторий существенно проще, так как лаборатории, как правило, уже имеют набор вспомогательного оборудования (вошеры, диспенсеры, шейкеры), а персонал —опыт работы с микропланшетами."

"Для диагностических исследований с использованием иммуночипов ключевыми являются не только аналитические характеристики —чувствительность, динамический диапазон выявляемых концентраций аналитов, воспроизводимость (точность), но и уровень требований к условиям проведения анализа (влияние примесей, влажности, температуры и т. п.), а также стоимость реагентов и анализа
в целом по отношению к замещаемым тестам."

"Ряд компаний (Abbot, Arrayit, Sensovation) ориентирован на серийное производство биочип-ска-
неров и выпуск биочипов на основе классических флуоресцентных меток (цианиновых красителей CY-3, CY-5, CY-7, красителей под торговой маркой ALEXA, флуоресцеина, родамина и т. п.) ."

"Отечественная технология иммуночипов (табл. 7.12), разработанная Институтом молекулярной биологии РАН, основана на формировании на микроскопных стеклах микроэрреев (диаметром 0,1 мм) на основе гидрогелей, образующих при полимеризации объемную структуру (Arenkov et al., 2000)."

"Разработки иммуночипов, осуществляемые в ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора РФ совместно с компанией ООО ・・Интерлабсервис・・, по существу являются трансфером технологий известных в этой области компаний, таких как Perkin-Elmer, Abbot, Arrayit, Sensovation (табл. 7.12) и следуют в форватере их технологических достижений."

"ФГУП ・・ГосНИИ биологического приборостроения・・ ФМБА России и компания ЗАО ・・ИММУНОСКРИН・・ создали и развивают (Патенты РФ № № 1707539, 2066455, 2184970, 2190208, 2197732) микропланшетную технологию иммуночипов ФОСФАН™"

"Аналитические характеристики сопоставимы с лучшими зарубежными технологиями по показателям чувствительности"

"Одно из наиболее важных и активно развивающихся направлений —использование мультианалитных систем в интересах обеспечения биологической безопасности. Разрабатываемые тесты предназначены для быстрого обнаружения в пробах из воды, воздуха, продуктов питания и клинических образцов возбудителей опасных инфекционных заболеваний (сибирской язвы, туляремии, сыпного тифа, клещевой пятнистой лихорадки, натуральной оспы и др.) и токсинов, которые могут представлять угрозу национальной безопасности при использовании в качестве биологического оружия или средства терроризма, и, кроме того, обусловлива-
ют заражение человека в природных очагах."

"В последние несколько лет как в России, так и за рубежом активно разрабатываются мультиплексные тесты для диагностики заболеваний группы ИКБ, клещевого энцефалита, гранулоцитарного анаплазмоза человека (табл. 7.13). Основное число разработок посвящено созданию мультиплексных тестов для дифференциальной серологической диагностики арбовирусных инфекций и заболеваний группы ИКБ у людей и животных. Основные результаты, полученные при диагностике КЭ и ИКБ"

 

[Ирина]

"К 2010 году только в США зарегистрировано около 80 коммерческих тестов (FDA, 2010), однако проблема ихстандартизации остается по-прежнему актуальной (раздел 7.1.3)."

"Ключевые элементы технологии ФОСФАН —приборы для регистрации фосфоресценции (фосфоресцентные сканеры), нанодозирующие устройства для ・・печати・・ микрозон на дне лунок планшетов (наноплоттеры), диагностические тесты (фосфоресцентные биочипы) и методики анализа разработаны в ФГУП ・・ГосНИИБП・・ ФМБА России совместно с ЗАО ・・Иммуноскрин ・・ (г. Москва) и защищены российскими патентами (№ № 1707539, 2066455, 2184970, 2190208, 2197732)."

"Применение ФОСФАН для решения ряда актуальных научных и практических задач показало (Осин и др., 2007а, б; Osin, Pomelova, 2008; Помелова и др., 2009а, б, в; 2010а, б, в; 2013), что этот подход может рассматриваться в качестве универсальной технологической платформы для проведения исследований в области биологической защиты, контроля токсикантов в окружающей среде, клинической лабораторной диагностики инфекционных заболеваний."

"Проведение анализа методом ФОСФАН осуществляется в лунках обычного полистиролового планшета (рис. 7.3б). Стадии анализа включают инкубацию анализируемой пробы в лунках планшета, промывание лунок для удаления не-
связавшихся компонентов реакции, биоспецифическое связывание выявляемого в пробе аналита со вторыми (индикаторными) антителами (или ДНК-зондом), конъюгированными с биотином. ・・Проявление・・ реакции осуществляется с помощью универсального реагента —конъюгата стрептавидина с Pt копропорфирином. Оптимальное соотношение сигнал/фон достигается при восьми−десятикратной молярной нагрузке метки на белок. Перед измерением лунки промывают дистиллированной водой и высушивают под струей воздуха."

"Учитывая большое разнообразие патогенов, которые способны одновременно существовать в экосистеме, возможность микст-инфицирования человека при контакте с переносчиками, зараженными одновременно несколькими возбудителями (раздел 5), а также потенциальную опасность использования ряда агентов в целях биотерроризма, це-
лесообразность использования биочип-технологии ФОСФАН при решении задач специфической индикации для выявления в пробах одного или нескольких патогенов представляется очевидной. К настоящему времени на основе технологии ФОСФАН разработаны тесты (фосфоресцентные иммуночипы) для детекции возбудителей ряда вирусных, бактериальных инфекций и токсинов"

"При параллельном обследовании 153 сывороток пациентов с эритемной или безэритемной формой ИКБ методами ФОСФАН и ИФА доля положительных
проб с IgG в ФОСФАН составила 70 % (63–7 %); в тесте С6 ELISA Immunetics
который выявляет антитела обоих классов, зарегистрирован близкий показатель чувствительности (табл. 7.16)."

"Специфичность ФОСФАН (обследовано 303 сыворотки от пациентов контрольной группы и доноров крови) составила от 93 до 99 %; специфичность американской тест-системы была несколько ниже (табл. 7.16), хотя наблюдаемые различия были статистически недостоверны"

"Перспективы ФОСФАН для сероэпидемиологического мониторинга и подтверждающей серодиагностики природноочаговых заболеваний связаны с разработкой мультиплексных тестов, позволяющих определять спектр антител к нескольким возбудителям. С учетом этого был разработан фосфоресцентный иммуночип для одновременного выявления G антител к вирусу КЭ и возбудителям ИКБ (Помелова и др., 2010в)."

"К настоящему времени описано применение технологии сухого пятна крови для выявления антител к возбудителям вирусных (гепатит А и В, краснуха, корь, свинка, лихорадка Денге) и бактериальных (лептоспироз, лепра, столбняк,
бруцеллез, сифилис, туляремия, аргасовый клещевой боррелиоз) инфекций, а также заболеваний, вызываемых простейшими (малярия, врожденный токсоплазмоз, лейшманиоз и др.) и филяриями (Коренберг и др., 1988; Крючечни-
ков и др., 1988; Parker, Cubitt, 1999)."

"Показана возможность использования сухих пятен цельной крови (или сывороток крови) для определения специфических IgM, IgG антител к возбудителям природноочаговых инфекций, таких как КЭ или ИКБ."

"Использование проб крови на бумаге —это перспективный малоинвазивный подход к диагностическому тестированию. Сбор крови на бумажные бланки может выполнять в любом месте минимально обученный персонал. Для прове-
дения исследований вполне достаточно обычного лабораторного оборудования (шейкеры, вошеры и т. п.), которое необходимо лишь дополнить ручными или автоматическими панчерами для ・・выбивания・・ дисков. Существующие диагностические подходы к исследованию сывороток, прежде всего иммуноферментные тесты, могут быть легко адаптированы для выявления антител в сухих пятнах крови. Применение проб крови на бумаге наиболее целесообразно при проведении масштабных скрининговых исследований в рамках сероэпидемиологического мониторинга и расшифровки вспышек заболеваний, контроле эффективности вакцинации, оценке уровня специфического иммунитета у жителей эндемичных регионов, контроле лечения. Такой подход может быть также использован при серологической диагностике острых заболеваний у госпитализированных людей, у которых взятие венозной крови затруднительно (дети, пожилые и длительно болеющие люди, наркоманы). Вместе с тем для внедрения технологии сухого пятна крови в практику лабораторной работы должны быть предприняты усилия по стандартизации процедуры сбора, транспортировки и хранения проб и разработке программ контроля качества измерений; кроме того, следует использовать бумагу, сертифицированную для сбора цельной крови (Hannon et al., 1989)."

 

[Ирина]

Стратегия и тактика профилактики

"Ежегодно с различными природными очагами инфекций, передающихся иксодовыми клещами, контактируют и подвергаются риску заражения десятки миллионов человек. Меры профилактики этих заболеваний могут быть направлены на создание иммунитета (специфическая профилактика) или на предотвращение нападения клещей путем ограничения их численности в природных очагах, а также использованием средств индивидуальной защиты."

"Представляется актуальным обсудить некоторые общие результаты профилактики инфекций рассматриваемой группы и ее возможную современную стратегию. При этом изначальноважно различать две взаимосвязанные, но далеко не идентичные задачи профилактики природноочаговых зоонозов: а) защита конкретного человека или ограниченной группы людей; б) снижение общего уровня заболеваемости в масштабах страны или крупных административных регионов (Коренберг, 2002, 2002b, 2010)."

"Современные возможности решения второй задачи довольно ограничены. Вместе с тем нельзя забывать, что в естественных экосистемах все паразиты выполняют определенную биоценотическую функцию и, в частности, представляют собой постоянно действующие факторы естественного отбора (Шмальгаузен, 1968; Сергиев, 2003)."

"Поэтому современная стратегия профилактики природноочаговых заболеваний должна в конечном счете сводиться не к элиминации возбудителей, а к сохранению их роли в экосистеме при безусловной защите людей от заражений
(Коренберг, 1983, 2000, 2002b). Наиболее
рациональную тактику применения различных профилактических средств в конкретном регионе выбирают исходя из местной специфики эпидемиологии комплекса инфекций, связанных с клещами, особенностей пространственного распределения природных очагов, а также степени регулярности заражения людей на той или иной территории
с учетом контингентов наибольшего риска (Коренберг, 2002)."

"Широко распространено мнение, основанное, по всей видимости, на достижениях специфической профилактики антропонозов (Сергиев и др., 2003), что единственный надежный способ профилактики природноочаговых заболева-
ний —вакцинация. Эта мера дает наибольший эпидемический эффект в том случае, если однократное введение препарата приводит к возникновению у пациента многолетнего и стойкого протективного иммунитета."

"При большинстве зоонозов даже после контакта человека с возбудителем в природном очаге, закончившимся заболеванием, уровень протективных антител довольно быстро снижается или они вообще утрачиваются (разделы 2.7; 3.7). Это объясняется отсутствием коадаптации организма человека и возбудителей природноочаговых инфекций.
Описаны повторные заболевания хантавирусными инфекциями, клещевым энцефалитом, аргасовым и иксодовым клещевым боррелиозом. Каким бы путем ни создавались вакцины, трудно рассчитывать на появление препаратов, которые будут длительно защищать от этих и других природноочаговых заболеваний (Коренберг, 2000; 2000b; Ананьина, Коренберг, 2002)"

"Следовательно, жителю эндемичной зоны только против этого заболевания вакцину нужно вводить на протяжении жизни примерно 20 раз, не пропуская при этом точные сроки ревакцинации. Это само по себе мало реально и, кроме
того, не может оставаться безвредным для иммунной системы человека, что вообще не принимают во внимание сторонники массовой вакцинации (Коренберг,2002b)."

"К тому же один клещ, как правило, содержит несколько различных возбудителей, и после его укуса человек рискует
заразиться несколькими возбудителями в отдельности или заболеть микст-инфекцией (раздел 5.6). Поскольку становятся известны все новые и новые широко распространенные и опасные возбудители, включая передающихся иксодовыми
клещами (разделы 1.4; 5), сложно представить количество вакцинных препаратов (даже если гипотетически предположить, что они могут быть созданы), которое должен получать человек, чтобы быть защищенным от всех этих заболеваний."

"Нужно также учитывать, что вакцина защищает от заболевания далеко не всех, получивших ее. Существует, однако, широко распространенное среди клиницистов мнение, что вакцинированные, даже если заболевают, то в ЛЕГКОЙ, чаще лихорадочной форме, без тяжелых поражений нервной системы. Довольно полный перечень публикаций, содержащих
такую констатацию, приведен в монографии А. П. Иерусалимского (2001, C. 247), включающий и работы опытных и известных клиницистов (П. С. Бабкин, В. М. Кантер, К. Г. Уманский), которые отмечали ・・…что по их данным клиническое течение КЭ у привитых ничем существенно не отличается от заболеваний у непривитых・・. Сам А. П. Иерусалимский констатировал, что у вакцинированных ・・были среди заболевших и очень легко протекавшие лихора-
дочные формы, были и очень тяжелые менингоэнцефалитические формы・・"

"Возникла необходимость в эпидемиологическом обосновании групп наибольшего риска заражения ・・клещевыми・・ ин-
фекциями среди городского населения (Ястребов, Хазова, 2011), причем в разных городах характеристики таких групп могут отличаться."

"Для специфической профилактики ИКБ американскими и европейскими фирмами были разработаны несколько различных вариантов вакцины. Их основной общий недостаток —поствакцинальные побочные эффекты (т. е. реактогенность препаратов) и короткий период сохранения протективных антител, что требует частой (длнекоторых препаратов —ежегодной) ревакцинации (Ананьина, Коренберг, 2002). В итоге, как констатировано в недавнем обзоре по проблемам заболеваний группы болезни Лайма, который подготовлен ведущими европейскими и американскими
специалистами (Stanek et al., 2012), вакцина для людей против этих инфекций сейчас отсутствует."

"Подходы к предупредительной терапии (антибиотикопрофилактике) ИКБ впервые обозначены
на международной конференции в середине 90-х годов (Korenberg
et al., 1994), а затем обоснование этого метода было представлено в отечественной и англоязычной научной печати (Коренберг и др., 1996; Воробьева и др., 1996; Korenberg et al. 1996; Воробьева 1998). Строго говоря, этот прием нельзя отнести ни к методам специфической, ни, тем более, неспецифической профилактики в общепринятой трактовке этих понятий, поскольку он заключается в превентивном приеме этиотропного антибиотика при обнаружении боррелий у клеща, прикрепившегося к телу человека."

"Идея предупреждения ИКБ путем применения антибактериальной терапии антибиотиками после укуса клеща в общей форме неоднократно высказывалась достаточно давно
Она основана на общеизвестной чувствительности боррелий к антибиотикам in vivo и in vitro, а также на том, что антибиотикотерапия боррелиозов тем эффективнее, чем скорее после начала заболевания она начинается (Steere et al., 1983). Однако многие американские врачи сомневались в целесообразности профилактики болезни Лайма анти-
биотиками даже в случае укуса человека инфицированным клещом (Castell et al., 1989; Diagnosis.., 1991; Shapiro et al., 1992, 1992a; Meek et al., 1994) или рекомендовали проводить ее лишь в тех случаях, когда клещ после присасывания находился на теле более 2 суток (Matuschka, Spielman A., 1993; Sood et al., 1994)."

"... данные об особенностях взаимоотношений боррелий с их основными евразийскими переносчиками позволили применительно к отработке способа профилактики боррелиозов сделать следующие заключения:
— зараженность боррелиями клеща, укусившего человека, может служить главным показанием для назначения процедур, способных предупредить возможность последующего заболевания;
—для поиска боррелий и определения риска заражении следует использовать даже таких клещей, которые находились на теле человека менее суток;
—технически простой, надежный и не требующий больших финансовых затрат способ быстрого выявления боррелий у клещей, начавших кровососание, —важнейшее условие эффективности подобной профилактической работы (Корен-
берг и др., 1996)."

"Был проведен и подробно описан эпидопыт (Коренберг и др., 1996), в котором при отсутствии каких-либо противопоказаний врач-инфекционист (Воробьева и др. 1996) назначал пациентам доксициклин (препарат выбора при лечении боррелиоза в дебюте заболевания) для перорального приема по 100 мг 2 раза в день в течение первых 3 или 5 дней после укуса инфицированным клещом."

"Кроме доксициклина (вибрамицина), применялись и другие антибиотики: тетрациклин, цефураксим (зиннат, зинацеф), сумамед (азитромицин). Их эффективность при назначении в первые 3 дня после укуса зараженного клеща составляет от 77,7 до 100 %. В последние годы такой способ профилактики боррелиоза стал шире применяться за рубежом,
и в частности в США (Nadelman et al., 2001; Warshafsky et al., 2010). Однако данная эффективная мера профилактики ИКБ должна применяться только при наличии соответствующих бактериолого-паразитологических показаний с разрешения
и под наблюдением врача. Бесконтрольное (без предварительного исследования присосавшегося клеща) введение антибиотиков всем пострадавшим от нападения переносчика нецелесообразно, поскольку неоправданное употребление антибиотиков может, как известно, оказаться в дальнейшем небезвредным для здоровья (Коренберг и др., 1996, 2007; Коренберг, 2002с)."

"Поскольку при лечении ГАЧ и МЭЧ, как и при ИКБ, в остром периоде заболевания применяют доксициклин, с большой вероятностью можно предполагать, что превентивная антибиотикотерапия может быть эффективной и для профилактики анаплазмоза и эрлихиоза. Косвенно об этом свидетельствует отсутствие этих заболеваний после подобной профилактики ИКБ, хотя микст-инфекции боррелиозно-анаплазмозной и боррелиозно-эрлихиозной этиологии —это довольно частое явление (раздел 5.6). Даже если это предположение подтвердится, предупредительную терапию, разумеется, нельзя будет считать универсальным способом профилактики инфекций, передающихся иксодовыми клещами."

 

[Ирина]

Подавление популяций переносчика

"Главная цель неспецифической профилактики природно-очаговых инфекций —подавление их паразитарных систем. Как правило, она достигается путем снижения численности, т. е. прямого уничтожения тех или иных видов позвоночных животных —носителей или членистоногих —переносчиков, поскольку ・・рукотворные・・ попытки воздействия изменением среды их обитания на сравнительно ограниченной территории обычно не приводит к желаемому даже среднессрочному результату (Коренберг, 1969 )"

"С 1958 г. авиахимический метод истребления клещей получил в РСФСР широкое распространение и стал ведущим в комплексе мер неспецифической профилактики КЭ. По отношению к взрослым клещам паразитологическая эффективность опытных ранневесенних обработок по снегу дустом ДДТ в первый сезон после их проведения на мало пересеченной местности составила 80–00 %, а по отношению к личинкам и нимфам —70–6 %. Эффект одно-кратного истребления клещей в разных условиях сохранялся от 3 до 10 (чаще 5) лет. Эпидемиологическая эффективность этих мероприятий оказалась очень высокой"

"Однако эпидемиологическая эффективность мероприятия далеко не всегда увеличивалась пропорционально наращиванию обработанной площади.
Несмотря на это, наиболее активно пропагандировавшаяся тактика борьбы с клещами заключалась в барьерно-кольцевой обработке вокруг городов и поселков или наращивании сплошной обработки лесных массивов вплоть до тотальной обработки всех лесов, которые постоянно посещаются населением (Горчаковская, 1965).
По существу это было равнозначно необходимости опыления значительной части лесной зоны. Подобная тактика в значительной мере подорвала оптимистические надежды санэпидслужбы на возможность дальнейшего снижения за-
болеваемости в масштабах страны с помощью истребления клещей и способствовала негативному отношению природоохранных организаций и общественности к этому мероприятию. Оно было эпидемически и экономически оправдано лишь в тех случаях, когда однократная обработка конкретных лесных массивов, занятых природными очагами с высоким эпидемиологическим потенциалом, предотвращала множество заражений, происходивших именно на этой территории и приводила к заметному снижению заболеваемости на протяжении нескольких
последующих лет."

"К концу 70-х−началу 80-х годов объем противоклещевых обработок в очагах КЭ сократился в 10 раз, а затем из-за большой токсичности и кумулятивных свойств ДДТ его применение в соответствии с приказом МЗ СССР (№ 139 от 02.03.1989) прекратилось."

"Но даже если бы он был, широкое применение химических методов борьбы с переносчиками в природных или урбанизированных экосистемах, неизбежно приводящее к их нарушению, в большинстве случаев уже просто недопустимо в связи с усиливающейся жизненной необходимостью охраны природы (Коренберг, 2010)."

"Однако противоклещевая обработка по четким эпидемиологическим показаниям ограниченной территории оздоровительных учреждений, воинских частей лесных поселений, садово-огородных и дачных участков (рис. 2.19) в тех случаях, когда она приводит к истреблению или существенному снижению численности клещей и защищает определенную группу людей, —несомненно, остается важным средством профилактики не только КЭ, но и всего комплекса инфекций, передающихся этими членистоногими (Коренберг, 2002b). Для этой цели в России разрешены к применению более десятка различных высокоэффективных по от-
ношению к клещам рода Ixodes акарицидных средств. Их общий недостаток —короткий период остаточного действия, который продолжается всего до 1–,5
мес. (Шашина, 2003, 2007; Шандала и др., 2006). Поэтому однократная обработка не ・・покрывает・・ весь период активации клещей, особенно в регионах, где он продолжается долго (раздел 2.5.4), что может требовать нескольких обработок в течение сезона (Метод. указания, 2012). В последние 10 лет (2003–012 гг.) в общей сложности по всей России такие локальные обработки ежегодно были проведены на площади от 23 887,3 га до 144 045,0 га. В Пермском крае, например, в 2012 г. было обработано 11 118 га, хотя, по мнению пермских специалистов (Девятков, Горбань, 2005), акарицидные обработки достигают порога своего влияния на уровень краевой заболеваемости уже при их годовом суммарном объеме 1150–200 га. В любом случае совершенно очевидно, что истребление клещей на таких не-
значительных площадях не может оказать сколько-нибудь заметное влияниена уровень заболеваемости КЭ в стране."

Индивидуальная защита
"После укуса одного клеща человек, как правило, рискует заразиться каким-то одним возбудителем (・・моноинфекция・・) или заболеть микст-инфекцией (раздел 5.6). Сейчас профилактика ИКБ в основном (Stanek et al., 2012), а ГАЧ и МЭЧ —исключительно осуществляется путем защиты от укусов клещей. Ее рациональные
меры должны одновременно защищать от всего комплекса инфекций, передающихся клещами (Коренберг, 2001, 2002, 2002b, 2003; Козлова и др., 2007), принося при этом минимальный ущерб природе (Коренберг, 1983, 2010; Коренберг,
Лихачева, 2003). Этим требованиям удовлетворяют и в обозримое время будут
удовлетворять только современные эффективные меры индивидуальной защиты (Коренберг, 2003; Korenberg, 2003; Шашина, Германт, 2012). К ним не относятся репеллентные средства, поскольку даже лучшие из них при нанесении на кожу отпугивают не более 30 % взрослых таежных клещей, а при нанесении на одежду в реальных условиях —до 60–0 % (Шашина, 2003, 2007)."

Еще не так давно необходимость разработки отсутствовавших отечественных эффективных способов и средств массовой индивидуальной защиты, предохраняющих человека от укуса клещей, и следовательно от любой передающейся ими инфекции, выглядела только как актуальная задача (Коренберг, 2002а, 2002b; Шашина, 2002). В наши дни существует около 20 доступных для населения отечественных аэрозольных препаратов на основе пиретроидных соединений, отличающихся стойким акарицидным действием. Они наносятся на одежду
и чрезвычайно эффективно препятствуют укусам напавших переносчиков, вызывая у них быстрый паралич и гибель, обеспечивая максимальный уровень защиты от клещей "

"Специальная одежда различной конструкции и покроя почти всегда входила в перечень средств индивидуальной защиты от клещей"

Санитарное просвещение и информирование населения

"Это положение было и остается важной элементарной темой целенаправленной санитарно-просветительной работы (Шашина, 2007). В целом она должна быть направлена на разъяснение населению всеми доступными средствами (радио, телевидение, пресса, интернет, листовки, плакаты и т. п.) арсенала средств специфической и неспецифической профилактики инфек-
ций, передающихся иксодовыми клещами, их свойств, преимуществ и недостатков применения, способов защиты от укусов клещей и алгоритма поведения в конкретных местных условиях при обнаружении на теле прикрепившегося клеща. Особенно важное значение приобретает пропаганда употребления современных средств индивидуальной защиты от клещей. Немалое значение в этом отношении может иметь реализация предложения Н. А. Пеньевской и др. (2011) об организации фармацевтического консультирования посетителей аптек. Важно проводить эту рабо-
ту круглогодично, и особенно интенсивно в конце зимы и ранней весной, до начала эпидемически опасного периода."

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

"Общая ситуация по природноочаговым инфекциям, и в частности по тем из них, которые передаются иксодовыми клещами, в стране, как и в мире, с годами не упрощается, а усложняется. Это объясняется рядом причин. Наиболее значимые из них — открытие неизвестных ранее патогенных для человека микроорганизмов, существующих в естественных экосистемах, и следовательно новых для науки и здравоохранения природноочаговых инфекций, а также неуклонно усиливающиеся процессы урбанизации, которые интенсифицируют контакты людей с ПРИРОДНЫМИ очагами. В этой связи возникают и постепенно решаются «неожиданные» медицинские проблемы, касающиеся совершенствования клинико-лабораторной диагностики, терапии и диспансеризации природнооча-
говых заболеваний. Но неизменными остаются задача мониторинга за состоянием природных очагов с целью прогнозирования их возможного эпидемического проявления и проблема перспективного эпидемиологически и экономически обоснованного планирования воздействия на заболеваемость природноочаговыми инфекциями, обеспечивающего снижение ее общего уровня в масштабах страны. Многолетние обсуждения этих задач научным сообществом и практическими работниками убеждают в том, что реальное продвижение в их решении
вряд ли возможно на путях прежних, почти не изменившихся на протяжении ряда ДЕСЯТИЛЕТИЙ подходов и стратегических принципов. Поэтому представляется, что настало время вернуться к идее создания единых государственных кадастров природных очагов болезней человека, которая была впервые предложена
достаточно давно (Коренберг, Кучерук, 1978; Коренберг, 1979)*, но затем в связи
с экономической ситуацией в стране, особенно после 90-х годов, по сути дела даже не обсуждалась."

"Ключевыми проблемами эпизоотологии и эпидемиологии инфекций, возбудители которых передаются иксодовыми клещами, как и всех природноочаговых зоонозов (Коренберг, 2010), по-прежнему остаются выявление биоценотических закономерностей существования возбудителей, а также причин, определяющих
динамику эпизоотического процесса и эпидемического проявления природных очагов."

 

[Ирина]

Я доработала еще выдержки из работы ученых, выделила жирным шрифтом особо значимое для нас.
Здесь выставлю в формате PDF.