1. Этот сайт использует файлы cookie. Продолжая пользоваться данным сайтом, Вы соглашаетесь на использование нами Ваших файлов cookie. Узнать больше.
Скрыть объявление
Немецкие анализы на боррелиоз и сопутствующие инфекции

В России появилась возможность выполнять лабораторные анализы на боррелиоз и ко-инфекции в немецкой лаборатории ArminLabs

Подробнее...

Боррелии IgG Вестерн-блот (Anti-Borrelia EUROLINE-WB (IgG))

Тема в разделе "Энциклопедия", создана пользователем Klever, 24 янв 2013.

  1. Klever
    Оффлайн

    Klever Ordnungsbeamter

    Сообщения:
    404
    Симпатии:
    330
    Боррелии IgG Вестерн-блот
    (Anti-Borrelia EUROLINE-WB (IgG))


    Набор EUROLINE-WB для определения IgG-антител к антигенам боррелий в сыворотке или плазме крови
    человека методом Вестерн-блота.
    Номер по каталогу: DY 2131-1601-1 G (набор на 16 определений)
    DY 2131-3001-1 G (набор на 30 определений)
    DY 2131-24001-1 G (набор на 240 определений)
    НАЗНАЧЕНИЕ
    Набор Anti-Borrelia EUROLINE-WB (IgG) обеспечивает количественное определение in vitro антител
    человека к антигенам боррелий в сыворотке и плазме крови.
    ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ
    Иксодовый клещевой боррелиоз или болезнь Лайма. Ассоциированные заболевания: хроническая
    мигрирующая эритема, доброкачественный кожный лимфаденоз, атрофический хронический акродерматит,
    артрит, кардит, нейроборрелиоз.
    ПРИНЦИП МЕТОДА
    Тест Anti-Borrelia EUROLINE-WB (IgG) основан на методе Вестерн-блота. Набор содержит тестовые
    стрипы с электрофоретически разделенными экстрактами, содержищими антигены Borrelia afzelii и
    мембранный чип с рекомбинантным антигеном VlsE (экспрессированная основная вариабельная
    белково-подобная последовательность). Стрипы блокируют и инкубируют на первой стадии реакции с
    образцом разведенной сыворотки или плазмы пациента. В случае, если образец положительный,
    специфические антитела класса IgG (а также классов IgA и IgM) будут связываться с антигенами. Для
    обнаружения связанных антител проводится вторая инкубация с использованием ферментного конъюгата
    (антитела к IgG человека, меченные щелочной фосфатазой), который способен вызывать развитие цветной
    реакции.

    МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
    Состав набора
    МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ.jpg

    Хранение и стабильность набора: Набор следует хранить при температуре от +2 °С до +8 °С. Не
    замораживать. Невскрытые компоненты набора сохраняют стабильность в течение всего указанного срока
    годности набора.
    Удаление отходов: Неразведенную сыворотку пациентов и стрипы для блота после инкубации следует
    рассматривать как инфицированные отходы и обращаться с ними соответствующим образом. Все реагенты
    следует удалять в соответствии с действующими официальными инструкциями.
    ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
    Примечание:
    Все компоненты каждой серии набора специально подобраны друг к другу. Чтобы обеспечить
    правильное выполнение теста, используйте только компоненты одной серии. Обратите внимание, что на
    пакете со стрипами, кроме номера серии, отпечатан дополнительный номер партии стрипов. Этот номер,
    относящийся только к партии стрипов, отпечатан также на соответствующем оценочном шаблоне с
    контрольным стрипом. Правильность оценки результатов анализа может быть гарантирована только в том
    случае, когда оба эти номера на пакете со стрипами и на шаблоне совпадают.
    Температуру всех реагентов необходимо довести до комнатной (от +18 °С до +25 °С) перед
    использованием.
    Стрипы, покрытые антигенами: Готовы к использованию. Во избежание конденсации влаги на стрипах, не
    вскрывайте пакет до тех пор, пока он не нагреется до комнатной температуры. Вынув необходимое
    количество стрипов, остальные неиспользованные стрипы немедленно плотно закройте в той же защитной
    упаковке и храните при температуре от +2 °С до +8 °С. После первого вскрытия упаковки плотно
    упакованные вновь стрипы с антигенами можно хранить минимум 2 месяца в сухом месте при температуре
    от +2 °С до +8 °С. Для обеспечения правильной оценки результатов следите, чтобы номер пакета со
    стрипами совпадал с номером на шаблоне.
    Ферментный конъюгат: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Для приготовления готового к
    использованию разведенного раствора ферментного конъюгата отберите необходимое количество жидкости
    из флакона с концентратом с помощью чистой пипетки и разведите 1:10 готовым к использованию
    универсальным буфером. Например, для проведения анализа на 1 тестовом стрипе разведите 0,15 мл
    концентрата ферментного конъюгата в 1,35 мл готового к использованию универсального буфера.
    Разведенный раствор ферментного конъюгата следует использовать до конца рабочего дня.
    Универсальный буфер: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Для приготовления готового к
    использованию универсального буфера отберите необходимое количество жидкости из флакона с
    концентратом с помощью чистой пипетки и разведите 1:10 деионизированной или дистиллированной водой.
    Например, для проведения анализа на 1 тестовом стрипе разведите 1,5 мл концентрата универсального
    буфера в 13,5 мл деионизированной или дистиллированной воды. Разведенный универсальный буфер
    следует использовать до конца рабочего дня.
    Раствор субстрата: Готов к использованию. После отбора необходимого количества реагента из флакона
    немедленно вновь закройте его, так как раствор чувствителен к свету.
    Предостережение: Используемая в шаблоне контрольная сыворотка была проверена на антитела к ВИЧ-1
    и ВИЧ-2 и вирусу гепатита С, а также на наличие HBsAg, методами иммуноферментного анализа или
    непрямой иммунофлуоресценции и показала отрицательный результат. Тем не менее, все используемые
    материалы следует считать потенциально опасными и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры
    предосторожности. Избегайте контакта с кожей.
    ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ОБРАЗЦОВ ПАЦИЕНТОВ
    Материал образцов:
    Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека.
    Стабильность: Образцы пациентов, предназначенные для исследования этим методом, можно хранить до
    14 дней при температуре от +2 оС до +8 оС. Разведенные образцы необходимо использовать в течение
    одного рабочего дня.
    Разведение образцов: Образцы пациентов разводят 1:51 разведенным универсальным буфером.
    Например: разведите 30 мкл образца в 1,5 мл разведенного универсального буфера и тщательно
    перемешайте на вортексе (пипетки для этого не подходят).
    ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
    Блокировка стрипов

    Заполните лунки пластикового лотка для инкубации в соответствии с количеством исследуемых образцов
    пациентов разведенным универсальным буфером (по 1,5 мл буфера на одну лунку). Выньте из упаковки
    требуемое количество блотовых стрипов и поместите каждый стрип в отдельную лунку. При этом должен
    быть виден номер стрипа, указанный в его нижней части. Инкубируйте 15 минут при комнатной температуре
    на шейкере рокерного типа. Затем аспирируйте всю жидкость из каждой лунки.
    Инкубация с образцом (1 стадия)
    Внесите в каждую лунку по 1,5 мл разведенного образца сыворотки или плазмы и инкубируйте при
    комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере рокерного типа.
    Промывка
    Аспирируйте жидкость из каждой лунки и затем промойте 3 раза по 5 минут, добавляя по 1,5 мл
    разведенного универсального буфера на лунку.
    Инкубация с конъюгатом (2 стадия)
    Внесите в каждую лунку по 1,5 мл ферментного конъюгата (меченные щелочной фосфатазой антитела к IgG
    человека). Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре на шейкере рокерного типа.
    Промывка
    Аспирируйте жидкость из каждой лунки и затем промойте 3 раза по 5 минут, добавляя по 1,5 мл
    разведенного универсального буфера на лунку.
    Инкубация с субстратом (3 стадия)
    Внесите в каждую лунку по 1,5 мл раствора субстрата. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной
    температуре на шейкере рокерного типа.
    Остановка реакции
    Аспирируйте жидкость из каждой лунки и затем промойте 3 раза по 1 минуте деионизированной или
    дистиллированной водой.
    ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
    Регистрация результатов реакции:

    После остановки реакции деионизированной или дистиллированной водой выньте из лотка
    проинкубированный стрип и, придерживая его двумя пинцетами, поместите в соответствующее место,
    расположенное на разлинованное и покрытое листом прозрачного пластика поле оценочного протокола,
    предназначенное для стрипов. Пока стрип влажный, его можно на пластике подвинуть. После высыхания
    стрипы прочно пристанут к пластику. После того, как вы поместите все стрипы в оценочный протокол, их
    необходимо крепко прижать листом фильтровальной бумаги. Если вы собираетесь получить результат в
    цифровом выражении, сканируя стрип с помощью программы EUROLINESCAN, поместите стрипы на
    пластик, как описано выше. После сканирования высохших стрипов их следует для дальнейшего хранения
    закрыть сверху другим листом пластиковой пленки.
    После этого приложите оценочный шаблон к стрипам на пластике так, чтобы черные полосы,
    расположенные над номерами стрипов, совпадали с черной полосой (alignment bar) контрольного стрипа на
    оценочном шаблоне. При этом номер на оценочном шаблоне должен совпадать с номером используемой
    партии стрипов. В оценочном протоколе следует отметить ясно различимые полосы на стрипах,
    совпадающие с отмеченными полосами антигенов контрольного стрипа.
    Примечание: На стрипах под номером расположена контрольная полоса. Интенсивное окрашивание
    этой контрольной полосы свидетельствует о правильности проведения инкубации.
    Антигены:
    Источником антигенов для тестов Anti-Borrelia EUROLINE-WB является специально
    подобранный штамм Borrelia afzelii (1, 2). Белки из экстракта боррелий были разделены по молекулярной
    массе методом прерывистого электрофореза в полиакриламидном геле и эти белки (антигены боррелий)
    были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану стрипов. Затем стрипы дополнительно были покрыты
    мембранным чипом, содержащим рекомбинантный антиген VlsE (экспрессированная основная
    вариабельная белково-подобная последовательность). VlsE является единственным липопротеином,
    экспрессирующимся in vivo и имеющим высокоиммуногенные консервативные эпитопы. Антитела класса IgG
    к этому белку являются высокоспецифичными и чувствительными маркерами боррелиозной инфекции. Два
    стрипа из каждого набора были проинкубированы с контрольной сывороткой и окрашены. Один из двух
    окрашенных стрипов был включен в набор в качестве контрольного, а второй – оставлен с целью
    документирования в компании EUROIMMUN. Диагностически значимые антигены белкового экстракта были
    охарактеризованы с использованием моноклональных референтных антител, полученных в немецкой
    Национальной Референтной Лаборатории боррелиозов (10).

    Специфичность антигенов, нанесенных на стрипы: (3, 4, 5, 12, 13)
    Специфичность антигенов нанесенных на стрипы.jpg
    Антитела класса IgG к Borrelia burgdorferi sensu lato
    Благодаря использованию высокоспецифичного и высокочувствительного рекомбинантного антигена VlsE
    можно быстро оценивать результаты теста Anti-Borrelia EUROLINE-WB.
    Быстрая оценка результатов по IgG:
    Быстрая оценка результатов по IgG.jpg
    Отрицательный результат по IgG-антителам к VlsE может быть получен на ранних стадиях боррелиозной
    инфекции и иногда – также на поздних стадиях. В этих случаях оценку следует производить по следующей
    схеме:
    Референтная оценка результатов по IgG:
    Референтная оценка результатов по IgG.jpg
    Антитела класса IgМ к Borrelia burgdorferi sensu lato
    Антитела класса IgM сформированные в ранней фазе боррелиозной инфекции, обычно направлены против
    антигена OspC (p 25). Обнаружение IgM-антител против других, видоспецифичных антигенов боррелий,
    необязательно должно свидетельствовать о недавно возникшей инфекции.
    Быстрая оценка результатов по IgМ:
    Быстрая оценка результатов по IgМ.jpg
    Если полоса антигена OspC не дает ясного результата при подозрении на боррелиозную инфекцию, оценку
    следует производить по следующей схеме:
    Референтная оценка результатов по IgМ:
    Референтная оценка результатов по IgМ.jpg
    $ картина окрашивания полос не типична для недавно возникшего боррелиоза Лайма

    Обнаружение IgM-антител против различных специфичных антигенов боррелий, при отсутствии антител к
    OspC, не считается достаточным указанием на недавно возникшую инфекцию.
    При серологических исследованиях боррелиозной инфекции определение антител класса IgM часто дает
    неясные результаты. IgM-антитела обнаруживают спустя годы после возникновения инфекции или после
    лечения антибиотиками. Поэтому наличие специфических антител класса IgM необязательно указывает на
    недавнюю инфекцию. В то же время, отрицательный результат по IgM-антителам не исключает наличия
    свежей инфекции. При повторном заражении могут формироваться только антитела класса IgG, но не IgM.
    На поздней стадии боррелиоза положительный результат по IgM-антителам не дает никакой
    дополнительной информации. Причина таких ложно положительных результатов часто остается
    невыясненной. Они наблюдаются, например, при инфекционном мононуклеозе, герпес-вирусной инфекции и
    при разнообразных аутоиммунных заболеваниях (10).
    Для установления диагноза свежей боррелиозной инфекции полученный положительный результат по IgM-
    антителам должен быть обязательно подтвержден через 3-6 недель положительным результатом по
    антителам класса IgG на свежевзятом образце крови.

    ХАРАКТЕРИСТИКИ ТЕСТА
    Диапазон определения:
    Метод EUROLINE-WB является качественным, диапазон определения не дается.
    Принято, что предельный титр антител наблюдается при разведении образца 1:51.
    Интерференция: Не отмечено изменения аналитических характеристик при исследовании в данном наборе
    гемолизированных, липемических или желтушных образцов.
    Вариации результатов в разных опытах и в одном опыте: Вариации результатов в разных опытах
    оценивали многократным повторным исследованием одних и тех же охарактеризованных образцов в
    течение нескольких дней, вариации в одном опыте – многократным исследованием охарактеризованных
    образцов в течение одного дня. В каждом случае интенсивность полос находилась в пределах
    установленного диапазона. Таким образом, данный тест EUROLINE-WB показывает очень высокую
    воспроизводимость в пределах одной постановки и между постановками.
    Распространенность: Образцы сыворотки от 115 клинически охарактеризованных пациентов и 80
    здоровых доноров крови исследовали с помощью набора Anti-Borrelia EUROLINE-WB.
    Распространенность.jpg

    Распространенность антител к боррелиям у пациентов на поздних стадиях заболевания коррелирует с
    данными из литературных источников (9). Причем, из сравнения данных следует, что обнаружение IgG-
    антител на ранних стадиях заболевания (стадии I и II) намного более эффективно, если в методе вестерн-
    блота в качестве источника антигенов кроме цельного экстракта боррелий используется рекомбинантный
    антиген VlsE. Благодаря использованию этого антигена, набор Anti-Borrelia EUROLINE-WB при неизменной
    специфичности, имеет более высокую чувствительность (13).
    Распространенность-2.jpg
    Распространенность антител к боррелиям в образцах сыворотки здоровых доноров крови коррелирует с
    данными из литературных источников (11).
    Перекрестные реакции: Качество используемых антигенов и их источников гарантирует высокую
    специфичность наборов EUROLINE-WB. В измерении перекрестных реакций нет необходимости, так как в
    данной диагностической системе можно прямо отличать специфические антигены от неспецифических.
    КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
    Патогенные для человека виды боррелий: Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii
    известны под общим именем Borrelia burgdorferi sensu lato. Боррелии принадлежат к семейству
    спирохетовых (Spirochaetaceae), которое включает следующие роды: Borrelia, Spirochaeta, Cristispira и
    Treponema. У человека боррелии являются патогенными агентами клещевых иксодовых боррелиозов или
    болезни Лайма (8, 9). В США из образцов зараженных пациентов высевается только B. burgdorferi sensu
    stricto, а в странах Европы – все три патогенные для человека вида боррелий (2).

    Антитела к боррелиям выявляются в сыворотке крови большинства инфицированных данной бактерией
    людей. Распространенность этих антител в нормальной популяции Германии составляет в целом менее
    15% без учета эндемичных областей. У людей, работающих в лесной зоне, антитела к боррелиям
    обнаруживаются в 40% случаев.
    Боррелиозная инфекция может проявляться в виде дерматологических, неврологических,
    офтальмологических заболеваний, заболеваний внутренних органов. По клиническим признакам выделяют
    три стадии боррелиоза:
    Стадия I: Типичным первичным проявлением боррелиозной инфекции является хроническая мигрирующая
    эритема, покраснение кожи, которое появляется вокруг места укуса клеща и распространяется от него в
    виде расширяющегося круга. Покраснение сопровождается напоминающими грипп общими симптомами с
    лихорадкой, ознобом, головной болью и рвотой. В некоторых случаях наблюдается также лимфоаденопатия
    (доброкачественный лимфаденоз кожный). Исходом стадии I может быть спонтанное выздоровление или
    перерастание ее в генерализованную форму боррелиоза. Фаза передачи инфекции в основном
    бессимптомна: на стадии I антитела класса IgM к боррелиям могут быть выявлены серологическими
    методами у 50-90% пациентов. Частота образования специфических антител класса IgG у этих больных
    существенно ниже. Однако, на этой стадии заболевания результаты серологических тестов часто бывают
    отрицательными. При наличии соответствующих симптомов рекомендуется наблюдение за пациентом на
    протяжении нескольких последующих недель.
    Стадия II: Через несколько недель или месяцев после укуса клеща может развиться ряд различных
    симптомов. Это в первую очередь неврологические проявления: менингит, энцефалит, асимметрический
    полиневрит, парез черепно-мозговых нервов, лимфоцитарный менингорадикулоневрит Боннварда. Часто
    также наблюдаются артриты, особенно коленных суставов и нелокализованные боли костей, суставов и
    мышц. Реже бывают кардиологические проявления, такие как миокардит и перикардит. Антитела к
    боррелиям на стадии II выявляются в 50% - 90% случаев. На ранней фазе этой стадии находят в основном
    антитела класса IgM, а в поздней фазе часто присутствуют только антитела класса IgG. Однако, уровни
    специфических IgM могут сохраняться в течение длительного времени.
    Стадия III: Типичным проявлением боррелиозной инфекции на стадии III являются хронический
    рецидивирующий эрозивный артрит, хронический атрофический акродерматит и прогрессирующий
    энцефаломиелит, который может протекать наподобие множественного склероза. При отсутствии лечения
    третья стадия может развиваться в течение нескольких лет или десятилетий после первичного
    инфицирования. На этой стадии уровни специфических IgG-антител значительно увеличены у 90-100%
    пациентов, тогда как антитела класса IgM обнаруживаются очень редко.
    У многих пациентов с различными симптомами (например, с экстенсивными осложнениями артрита или с
    выраженными неврологическими симптомами), причины которых ранее не были ясны, серологическим
    путем может быть выявлена боррелиозная инфекция (возбудитель Borrelia burgdorferi). Для постановки
    диагноза нейроборрелиоза особенно важно определение антител в спинномозговой жидкости. Это лучше,
    чем тестирование сыворотки, так как мешающие проведению теста перекрестно-реагирующие антитела в
    спинномозговой жидкости присутствуют реже, чем в сыворотке, в связи с чем положительная реакция
    ожидается только в случае наличия нейроборрелиоза.
    В настоящее время дискутируется применение нескольких методических подходов для определения
    антител к Borrelia burgdorferi: ИФА, иммунофлуоресценции, пассивной гемагглютинации и Вестерн-блота.
    Многие исследователи применяют ИФА параллельно с тестом непрямой иммунофлуоресценции для того,
    чтобы предварительно охарактеризовать образец сыворотки. Субстраты, использованные как в наборе
    EUROIMMUN Anti-Borrelia-burgdorferi immunofluorescence test, номер по каталогу FI 2132, так и в наборе
    EUROIMMUN Anti-Borrelia-burgdorferi ELISA, номер по каталогу EI 2132, содержат полный спектр
    антигенов этих бактерий. Согласно общему мнению, использование препаратов подобного типа
    обеспечивает более высокий уровень диагностической точности, чем применение отдельных антигенов. Для
    подтверждения позитивных образцов особенно подходят наборы EUROIMMUN Anti-Borrelia-afzelii-
    WESTERNBLOT, номер по каталогу DY 2131, набор EUROIMMUN Anti-Borrelia-burgdorferi-
    WESTERNBLOT, номер по каталогу DY 2132, EUROIMMUN Anti-Borrelia-garinii-WESTERNBLOT, номер по
    каталогу DY 2134 и EUROIMMUN Anti-Borrelia EUROLINE-WB, номер по каталогу DY 2131-1.

    Протокол инкубации
    Протокол инкубации.jpg

    Источник материала - ЗАО "Аналитика"
    Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2005​
     
    Последнее редактирование: 24 янв 2013
    Jelena, Рудневы и Vatrushka нравится это.
  2. Vatrushka
    Оффлайн

    Vatrushka Модератор

    Сообщения:
    5.474
    Симпатии:
    3.955
    Откуда:
    Москва и МО
    Для Anti-Borrelia EUROLINE-WB IgG были изменены критерии оценки результата: те результаты,
    которые раньше относились к пограничным, теперь классифицируются как отрицательные
    (см. табл. ниже).
    upload_2015-8-21_0-25-19.png
    http://www.analytica.ru/EuroLineScan/borrelii.pdf
     
    Klever, Jelena и Niko нравится это.
Загрузка...

Поделиться этой страницей