ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОРМЫ ИНФЕКЦИОННОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ (Лекция) (+)

В данной лекции мы обсудим возможности серологической диагностики инфекционных заболеваний и варианты трактовки получаемых результатов. При этом сразу необходимо отметить, что только клиницисту, а не врачу-лаборанту, принадлежит право ставить диагноз (на основании анамнеза, клинических проявлений и данных лабораторных исследований). При хронических, персистирующих формах инфекций сделать это бывает непросто. В таких случаях результаты лабораторных исследований могут существенно помочь врачу. Установить этиологию и, возможно, стадию инфекционного заболевания – вот цель лабораторной диагностики.
Ни один метод лабораторного исследования не дает исчерпывающей информации об инфекционном заболевании. Поэтому в лабораторной диагностике необходимо использовать комплексный подход – проводить исследования разными методами.
Считается, что наиболее убедительным для лабораторной диагностики инфекций является выявление живых инфекционных агентов (микроорганизмов), т.е. использование микробиологического метода. Однако иногда это сделать затруднительно. Вирусы и хламидии, например, очень сложно культивировать; при транспортировке проб с клиническим материалом происходит гибель искомых микроорганизмов; кроме того, некоторые микроорганизмы, персистируя в организме человека, переходят в формы, неспособные к росту на питательных средах.
Выявить антигены или ДНК возбудителей инфекций тоже не всегда возможно, например, в связи с тем, что они, как и сами микроорганизмы, не всегда доступны при заборе материала (например, при восходящих инфекциях).
Кроме прямых методов выявления микроорганизмов, существуют непрямые методы, определяющие наличие возбудителей инфекций опосредовано, через иммунный ответ организма человека.
Серологическая диагностика основывается на определении в сыворотке крови специфических антител (АТ), образующихся в организме человека в ответ на присутствие инфекционных агентов. Известно, что иммунная реакция является высоко специфической, и именно это свойство использовано при выявлении АТ. В основе серологических методов - специфическое взаимодействие антиген-антитело. Антиген - это специфическая часть инфекционного агента, которая вызывает выработку антител в человеческом организме. Антитело нейтрализует инфекционный агент, взаимодействуя с антигеном. Антитела – это иммуноглобулины (Ig) классов А, М, G, (Е, D). IgЕ вырабатываются при аллергических реакциях, IgD – при аутоиммуных реакциях. Предметом обсуждения в данной лекции является значимость иммуноглобулинов классов M, A, G в диагностике инфекционных заболеваний.
Свойства этих иммуноглобулинов описаны в таблице 1.
Ig отличаются друг от друга по молекулярной массе, по времени образования в ответ на появление антигенов, по времени циркуляции в кровяном русле, по функциям.


IgM - наиболее ранние АТ, которые появляются на 3-7 день от начала заболевания. В случае гепатита А, например, - за неделю до появления первых клинических симптомов. Это первое звено иммунной реакции организма. Они очень быстро синтезируются, но циркулируют в крови недолго и достаточно быстро выводятся (в среднем за 10 - 15 дней). IgM обладают нейтрализующей активностью, но довольно слабой, т.к. их специфичность (т.е. точное соответствие мишени, которую эти АТ должны нейтрализовать) невысока. Именно с низкой специфичностью IgM связаны перекрестные реакции, например, с ревматоидным фактором, и получение ложноположительных результатов в диагностических тестах.

Выявление IgM указывает на развитие первичной инфекции.
Для определения первичного инфекционного процесса можно использовать также выявление низкоавидных антител IgG.
При первой встрече инфекционных агентов с иммунной системой макроорганизма плазмоциты синтезируют, как уже упоминалось, IgM. Затем эти же клетки переключаются на синтез IgA и IgG. При этом IgG сначала вырабатываются не достаточно специфичные, низкоавидные, они связываются с соответствующими антигенами непрочно. Авидность характеризует силу связывания АГ-АТ, т.е. специфичность АТ. Низкоавидные IgG появляются на 5-7 день, т.е. примерно одновременно с IgM.
В течение нескольких дней (7-10) происходит модуляция этих антител и выбор организмом высокоавидных IgG - тех, которые максимально эффективно (специфично) связываются с антигенами и нейтрализуют инфекционные агенты (см. ниже).
Ранние, низкоавидные антитела IgG, характерны только для первичного острого инфекционного процесса. При рецидивах эти АТ уже не вырабатываются.
Тест-систем, определяющих авидность IgG пока немного (для токсоплазм, вирусов краснухи, ЦМВ, ВПГ). Эти тесты очень важно использовать в сомнительных случаях для подтверждения первичной инфекции или снятия подозрений, например, когда выявили слабоположительные IgM. Особенно актуально это уточнение при ведении беременных.
Для инфекций, которые способны переходить в хронические, персисирующие формы, характерно рецидивирующее течение, периодические обострения. При рецидивах организм, как правило, не реагирует выработкой IgM (хламидиозы, ЦМВИ, инфекция ВПГ и др.). Иногда IgM вырабатываются в небольших количествах и кратковременно, но практически нет шансов их обнаружить. Применение тестов на выявление IgM в случаях хронических инфекций не обладает диагностической ценностью, т.к. отрицательный результат может с большой вероятностью соответствовать развивающейся инфекции. Как же определить обострение хронической инфекции?
При ряде вирусных заболеваний (ВПГ 1,2 и ЦМВ) для диагностики, как первичной инфекции, так и рецидивов, существует возможность выявления IgG к предранним (неструктурным) белкам.
Известно, что вирусы являются облигатными клеточными паразитами и неспособны к самостоятельному размножению. Их жизненный цикл начинается с репликации геномов (в случае герпесвирусов это ДНК), при этом вирусы заставляют клетки, в которых они паразитируют, работать на себя, производить необходимые для репликации и сборки новых полноценных вирусных частиц ферменты, а затем и структурные белки для вирусной оболочки. Во время образования копий вирусных геномов, еще до сборки полноценных вирусных частиц, человеческий организм реагирует на чужеродные вирусные белки (предранние, регуляторные, неструктурные, участвующие в репликации ДНК вирусов) образованием IgG. Это происходит при каждом обострении инфекции, на 3-5 день после начала развития инфекционного процесса. Такие IgG к предранним белкам вирусов циркулируют в крови до месяца после завершения вирусной активности. По количественному показателю IgG к предранним белкам вирусов, в динамике, можно судить не только об активности вирусной инфекции, но и о направлении процесса – угасание (например, в результате успешной терапии) или развитие. Во время ремиссии (латенции, персистенции) нет активности жизненного цикла и репликации геномов вирусов, поэтому IgG к предранним белкам вирусов не вырабатываются.
Для герпесвирусов (ЦМВ и ВПГ 1,2) созданы тест-системы для выявления IgG к предранним белкам. Использование их очень актуально. Это связано с тем, что до 80% населения, являясь носителями вирусов, для успешного лечения сталкиваются с необходимостью диагностировать именно начало рецидива, а не первичной инфекции. При этом обострения вирусных инфекций могут не иметь клинических проявлений (в случаях ЦМВИ, инфекций, вызванных ВПГ 2-ого типа - до 20% во время первичной инфекции и до 70% при рецидивах).
Единственными однозначными маркерами активности рецидивирующих вирусных инфекций являются IgG к предранним белкам вирусов.
Для лабораторной диагностики бактериальных хронических инфекций анализируют сочетание выявления в динамике IgA и IgG.
IgA - секреторные АТ, синтезируемые, как и другие Ig, плазмоцитами. Они образуются в тканях в местах поражения (в слизистых оболочках урогенитального тракта, кишечника, дыхательных путей). Часть IgA поступает в кровяное русло (50%). Определять их можно в местном секрете и в сыворотке крови.
Эти АТ вырабатываются в ответ на появление в организме инфекционных агентов после IgM (таблица 1). IgA обладают более выраженной активностью, нейтрализующей инфекционные агенты, чем IgM, связываются с инфекционными агентами местно, в очаге поступления и развития инфекции.
В диагностической практике выявление IgA играет важную роль. Рассмотрим это на примере лабораторной диагностики хламидиоза.
Известно, что для хламидиозов характерен высокий уровень хронизации инфекции. На ранних стадиях первичной инфекции больные редко обращаются к врачу, поскольку симптоматика заболевания слабо выражена. Как правило, врачу приходится диагностировать хронический хламидиоз. В таких случаях IgM уже не вырабатываются, поэтому определять их не имеет смысла.
На второй неделе течения заболевания появляются IgA и присутствуют далее, откликаясь на обострение инфекции повышением титра. Положительный результат анализа на IgA свидетельствует о наличии инфекционного процесса. А при контроле излеченности исчезновение IgA достоверно подтверждает удачно проведенный курс терапии. Если же после проведения лечения обнаруживаются IgA, то это показатель неуспешного лечения, и течения болезни в хронической форме или персистенции. Только когда окончательно исчезают IgA и остаются только IgG, можно быть уверенным, что лечение хламидиоза завершилось успешно. Однако надо помнить, что при персистенции хламидий IgA содержатся в крови в небольшом количестве и выявляются в низких титрах и нестабильно (то выявляются, то – нет). Поэтому отрицательный ответ при проверке излеченности надо вновь воспроизвести через месяц, затем через два месяца. Для диагностики форм хламидиоза имеет смысл определять сочетание IgA и IgG. Наличие IgA и IgG свидетельствует о развитии заболевания Низкие титры IgA, при отсутствии IgG означают персистенцию хламидий в организме. Низкие титры IgG и отсутствие IgA – иммунологический шрам, свидетельствующий о давно перенесенной инфекции. Хламидийные IgG могут циркулировать в кровяном русле до 5 лет после излеченности, при этом иммунитет к повторному заражению они не обеспечивают.
В иммунном ответе организма на процесс развития первичной инфекции последними вырабатываются высокоавидные IgG, которые принято называть поздними IgG, или просто IgG (в среднем через 2 недели от начала). Это и есть основное звено защиты, самые специфичные и активные в плане нейтрализации инфекционных агентов АТ. Поздние, высокоавидные IgG, могут обнаруживаться либо на поздней стадии первичного инфекционного процесса, либо при хроническом течении инфекции, либо свидетельствовать о давно перенесенном заболевании. После болезни они содержатся в крови человека месяцами, иногда годами. Для инфекций, возбудители которых широко циркулируют в окружающей среде, характерно выявление IgG пожизненно (иммунитет подстегивается встречами с инфекционными агентами). Именно эти АТ обеспечивают иммунитет к краснухе, кори, гепатиту А и др. До 70-80% населения имеют IgG к вирусам гепатита А, порой даже не зная, что переболели этим заболеванием (иногда протекает бессимптомно).
При классических, не хронизирующих инфекциях (корь, краснуха) выявление высокого уровня высокоавидных IgG (при отсутствии IgM и низкоавидных IgG) говорит о наличии иммунной защиты. Для хронических инфекций высокий уровень поздних IgG может соответствовать тяжелому варианту хронизации инфекции (восходящий хламидиоз, болезнь Рейтера) или рецидиву (ЦМВ и ВПГ 1,2).
Концентрация IgG может меняться в зависимости от стадии заболевания, от состояния иммунной системы пациента вообще и на момент обследования в частности. Например, при наличии иммуносупрессии, которую в частности может вызывать длительное течение хронической вирусной инфекции, во время рецидива количество поздних IgG совсем не увеличивается, или увеличивается, но не в 4 раза, как при классическом иммунном ответе на рецидив. Поэтому количественный показатель IgG не всегда обладает диагностической ценностью. В некоторых случаях, когда отсутствуют другие тест-системы для лабораторной диагностики развития хронических инфекций, диагностическая значимость нарастания титра IgG существенна, например, для диагностики токсоплазмоза и трихомониаза.
Только IgG проходят через плаценту и поэтому защищают плод от данной инфекции (таблица 1). Проверить наличие поздних IgG важно для ведения беременных (к токсоплазмам, к вирусам краснухи, ЦМВ и ВПГ). Серонегативные пациентки подвержены риску первичного заражения.
Выявление только поздних IgG не дает диагностической ясности и свидетельствует лишь о носительстве. Полную информацию о форме заболевания на момент обследования можно получить, анализируя результаты исследований и предранних IgG, и поздних IgG к ЦМВ и ВПГ.
В случае ЦМВИ и инфекции ВПГ 1, 2 отсутствие IgG к предранним белкам вирусов (ранних АТ) и выявление поздних IgG (в любом титре) свидетельствует о ремиссии (латенции, носительстве) хронической формы заболевания. Для беременных это означает, что нет угрозы первичного заражения, и рекомендуется периодическое обследование на наличие IgG к предранним белкам вирусов (чтобы в случае их обнаружения в нарастающих титрах применять соответствующую терапию). Если не обнаруживаются ни предранние, ни поздние IgG, то это значит, что в организме нет развития данной вирусной инфекции и никогда не было, т.е. нет носительства этих вирусов. Беременным надо опасаться в этом случае возможного первичного заражения. Выявление и предранних, и поздних IgG однозначно свидетельствует о развитии инфекции (независимо от уровня поздних IgG). По количественному показателю предранних IgG можно следить за развитием вирусной инфекции или за динамикой угасания обострения и уходом в ремиссию.
Выявление предранних IgG и/или IgM при отсутствии или низком титре поздних IgG свидетельствует о первичном инфекционном процессе.
Итак, факт наличия первичной инфекции можно установить выявлением антител: IgМ, низкоавидных IgG, IgG к предранним белкам вирусов при отсутствии или низком титре поздних IgG. Маркерами рецидивов являются IgG к предранним белкам вирусов (ЦМВ, ВПГ 1, 2), IgA (хламидии), нарастание титров поздних, высокоавидных IgG (токсоплазмы). А IgG (поздние, высокоавидные) при отсутствии других – свидетельствуют о прошедшей инфекции (краснуха), носительстве (герпесвирусы).
Современный надежный метод выявления Ig – иммуноферментный анализ (ИФА).
В таблице 2 приведены общие сведения о динамике появления Ig классов M, A, G на разных стадиях развития инфекции,
а также о возможности применения прямого метода ПЦР диагностики для выявления возбудителей инфекций в мазках/соскобах из потенциальных мест обитания или очагов воспаления.


Наиболее достоверными и диагностически значимыми являются результаты лабораторных исследований Ig, полученных в динамике (принцип парных сывороток). Повторные анализы проводят через 2-3 недели.
В случае контроля излеченности следует провести исследования Ig через 1-2 месяца (после лечения острой инфекции) и через 2-3 месяца и даже через полгода (после лечения хронических форм заболеваний).
Особенности выработки Ig для разных микроорганизмов определяют их диагностическую значимость. Так, например, для урогенитальных микоплазм и уреаплазм не рекомендуется определять Ig в диагностических целях, т.к. из-за отсутствия клеточной стенки и особенностей биологии и антигенной структуры данных микроорганизмов профиль иммунного ответа искажается. Изменчивая антигенная структура гонококков не дает возможности создать тест-системы для выявления специфических Ig. Антитела к резидентной флоре (кандида, анаэробы, неспецифическая микрофлора и др.) не имеет смысла определять в диагностических целях, т.к. они не отражают инфекционного процесса, а откликаются на присутствие комменсалов в организме человека.
Стратегия использования ИФА-тестов для выявления Ig классов М, А и G отличается для разных инфекций. Для урогенитального хламидиоза используют диагностическую пару IgA и IgG, для ВПГ и ЦМВ – IgM, IgG и IgG к предранним белкам вирусов, для токсоплазмоза и краснухи – IgM, IgG и тест на авидность IgG, для ВЭБ – Ig к разным антигенам (см. Приложение – «Интерпретация результатов».


Что такое высокие и низкие титры?
Уровни Ig зависят от иммунной системы человека. Поэтому количественные показатели могут отличаться у разных людей (индивидуальные особенности) при одной стадии развития одной и той же инфекции. Так, если проводить вакцинацию коллектива одной вакциной, в один день, а через определенное время проверить иммунный ответ, то количество выработанных АТ у людей будет разным: 5% не отреагируют выработкой АТ, 10-15% дадут низкий уровень, большая часть – средний уровень (1:40-1:160), 15% - очень высокий уровень. Также и разные больные реагируют на одни и те же инфекционные агенты. Бывает, что высокие титры АТ свидетельствуют о давно перенесенной болезни, а низкие – об остром процессе. Важно, что выявление, например, предранних н низкоавидных АТ однозначно свидетельствует об обострении или первичном развитии инфекции. На фоне подавленного иммунитета часто рецидивирует герпесвирусная инфекция, – в таких случаях важно выявлять IgG к предранним белкам и получать качественное свидетельство развития инфекции. Кроме того, иногда само заболевание, например, хламидиоз, вызывает подавление иммунитета. Поэтому только исследование парных сывороток (через 2-3 недели) даст результат в динамике, который можно более достоверно трактовать, с учетом индивидуальных особенностей иммунной системы. В среднем низкие титры – это 1:20-1:40, высокие – 1:160 и более.

Как трактовать результаты, если определение возбудителя методом ПЦР дает положительный ответ, а Ig не выявляются?

• Для начала развития инфекции и появления иммунного ответа необходимо достаточно большое количество инфекционных агентов и определенный отрезок времени присутствия их в организме человека. ПЦР-определение могло выявить возбудителей, а иммунная система еще не отреагировала накоплением Ig.
• Может быть снижен или подавлен иммунитет, в результате чего не накапливается определяемое количество антител.
• При бессимптомном носительстве микроорганизмов АТ могут не выявляться (это распространенное явление).
• Из-за особенностей антигенной структуры простейших (токсоплазм, трихомонад) иммунный ответ на них нестабильно проявляется, бывает смазанным, поэтому сложно трактовать результаты исследований Ig.